趙先勝，任志群

(1.浙江省寧波市傳染病醫(yī)院，浙江 寧波 315010; 2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝病科，陜西 西安 710061)

腫瘤的侵襲生長(zhǎng)是一個(gè)多因素、多步驟的過程，細(xì)胞外基質(zhì)(主要是Ⅳ型膠原蛋白)不僅是腫瘤細(xì)胞賴以生存的場(chǎng)所，還是腫瘤細(xì)胞遷徙的天然屏障。CD147又被稱為促細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)或basigin，在腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)，刺激腫瘤細(xì)胞周圍的成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)。研究發(fā)現(xiàn)，CD147在多種腫瘤中高表達(dá)，同時(shí)MMP活性增加，與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。筆者通過下調(diào)CD147基因表達(dá)來觀察肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的改變，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

含有人 U6啟動(dòng)子的 pSilencerTM4.1－CMV neo質(zhì)粒(美國(guó)Ambion公司);大腸桿菌DH5α(大連寶生物工程有限公司);限制性內(nèi)切酶(Bam HⅠ，HindⅢ)、T4 DNA連接酶(美國(guó) NEB公司);DNA marker(大連寶生物工程有限公司);質(zhì)粒小量抽提試劑盒(天為時(shí)代公司);膠回收試劑盒(廣州美津生物公司);Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、G418(美國(guó) Invitrogen公司);內(nèi)參 β－actin、CD147單克隆抗體(美國(guó)R＆D公司)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的制備

根據(jù)美國(guó)基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的CD147基因核苷酸序列(NM_198589)，輸入Ambion公司的在線siRNA設(shè)計(jì)軟件，軟件將自動(dòng)分析和顯示候選siRNA。根據(jù)文獻(xiàn)[3－4]報(bào)道的siRNA設(shè)計(jì)原則和經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)一步在候選siRNA中篩選最佳者。設(shè)計(jì)的siRNA由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，引物序列見正義鏈:5'－AGCTTAAGACCTTGGCTCCAAGATACTCTCTTGAAGTATCTTGGAGCCAAGGTCG－3';反義鏈:5'－GATCCGACCTTGGCTCCAAGATACTCAAGAGAGTATCTTGGAGCCAAGGTCTTA － 3'。

1.2.2 CD147/siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

參照Ambion公司說明書，將合成的siRNA連接至pSilencerTM4.1－CMV neo質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，用質(zhì)粒小量抽提試劑盒小量提取質(zhì)粒后，載體CD147/siRNA經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，樣本送檢行DNA測(cè)序。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選

細(xì)胞培養(yǎng)條件為10%胎牛血清、100 g/L青霉素和100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h用2.5 g/L胰蛋白酶消化人HepG2細(xì)胞，具體操作按Invitrogen公司轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamin2000操作說明書進(jìn)行。

1.2.4 蛋白印記試驗(yàn)檢測(cè)CD147基因表達(dá)

用蛋白裂解液RIPA裂解HepG2細(xì)胞，測(cè)定蛋白濃度，行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，10%BSA血清封閉液中封閉1 h，然后鼠抗人－CD147單克隆抗體(1∶500)4℃孵育過夜，TBST液清洗3次，每次10 min，而后再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體(1∶5 000)室溫孵育2 h，在暗室中，采用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑盒進(jìn)行發(fā)光，暗室曝光。

1.2.5 MTT 法測(cè)定細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的各組細(xì)胞，每孔按濃度為5×103個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板上，接種后48 h，用MTT法分別測(cè)定每孔光密度，各組細(xì)胞均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取平均值計(jì)算細(xì)胞活性。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞加入培養(yǎng)緩沖液，按Immuno－tech公司的說明書進(jìn)行，1×106個(gè)/mL細(xì)胞用冰PBS液洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106個(gè) /mL，加 5 μL Annexin V 液(1∶10稀釋)和 5 μL 碘化丙錠(250 μg/mL 于 490 μL 細(xì)胞懸液中，冰浴放置 10 min，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 重組載體的鑒定

結(jié)果見圖1。采用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切重組載體，12%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，可見55 bp處有明顯條帶(圖1 A)，相應(yīng)部位測(cè)序后證實(shí)堿基序列和設(shè)計(jì)序列一致(圖1 B)，表明載體構(gòu)建正確。

圖1 限制性內(nèi)切酶鑒定CD147/siRNA重組表達(dá)載體及重組質(zhì)粒測(cè)序

2.2 siRNA對(duì)CD147蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果見圖2。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，siRNA組表達(dá)量明顯下降，但未處理的HepG2組及轉(zhuǎn)化的空質(zhì)粒組表達(dá)量無明顯變化。

圖2 各位細(xì)胞中CD147蛋白表達(dá)情況

2.3 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活性

結(jié)果見圖3。siRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯影響 (P＜0.05)，空白對(duì)照組及空質(zhì)粒之間細(xì)胞增殖情況無顯著性差異(P ＞0.05)。

圖3 MTT法檢測(cè)48 h后各組細(xì)胞活性

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

轉(zhuǎn)染siRNA組的細(xì)胞的凋亡率顯著增加(14.85 ±1.35)%，與未轉(zhuǎn)組(4.51±0.36)%、轉(zhuǎn)染空 siRNA 載體組(6.13% ±0.71)%比較，差異有顯著性(P＜0.05)，說明沉默CD147基因表達(dá)可增加細(xì)胞的凋亡。

3 討論

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)所引起的序列特異性基因沉默，siRNA是21－23 nt小片段雙鏈RNA，可以特異性和互補(bǔ)靶基因mRNA序列結(jié)合，誘導(dǎo)其降解，產(chǎn)生強(qiáng)大的RNA干擾效應(yīng)[1－2]。siRNA與靶序列之間嚴(yán)格的堿基配對(duì)，具有很強(qiáng)的特異性，它可以在染色質(zhì)水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平中參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。盡管RNAi的效果看似和靶序列與siRNA的結(jié)合性有關(guān)，但目前并沒有可靠的方法來預(yù)判或鑒別RNAi的理想靶序列[3]。有報(bào)道指出，化學(xué)合成和載體介導(dǎo)的siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括惡性腫瘤細(xì)胞中都能成功地沉默特定的基因[4]。

Biswas等[5]將CD147分子純化后，發(fā)現(xiàn)CD147能體外誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成 MMP－1，MMP－2，MMP－3。隨后對(duì) CD147研究發(fā)現(xiàn)，在骨巨細(xì)胞瘤、泌尿系腫瘤、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成釉細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、骨髓癌、皮膚基底細(xì)胞癌、黑色素瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)CD147表達(dá)升高，同時(shí)MMP活性增加，且與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]。在后續(xù)的一些研究中，人們發(fā)現(xiàn)CD147分子亦可作為評(píng)價(jià)多種惡性腫瘤預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)[6]，其高表達(dá)往往提示腫瘤的預(yù)后不良。

肝癌因其惡性程度高、預(yù)后差，一直受到人們的關(guān)注，其藥物治療已經(jīng)有了很大的進(jìn)展[7]。中醫(yī)藥也已有一定作用，但總體效果欠佳[8]。筆者根據(jù)美國(guó)基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的CD147基因核苷酸序列，參考siRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出了兩條針對(duì)CD147基因表達(dá)的RNAi序列，并成功克隆至載體CD147/siRNA，試驗(yàn)證明它能下調(diào)肝癌細(xì)胞CD147蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。提示抑制CD147基因表達(dá)，是肝癌治療的一個(gè)靶點(diǎn)，為肝癌的基因治療提供了可能。

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