牛 輝 陳光裕 苑克偉 史美龍 陳治龍 (北華大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，吉林 吉林 320)

胃癌的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(ACE)，又稱激肽酶Ⅱ，是高血壓和腎臟疾病研究的熱點(diǎn)基因。近年來，發(fā)現(xiàn)其在腫瘤血管生成、細(xì)胞生長、遷移和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用〔1〕。ACE抑制劑能夠抑制腫瘤生長、血管生成和細(xì)胞基質(zhì)降解〔2〕。ACE蛋白質(zhì)和 mRNA在胃癌中明顯高表達(dá)〔3〕，然而，ACE mRNA與胃癌臨床病理特征的關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ACE mRNA在胃癌中的表達(dá)，并探討其與胃癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 胃癌及癌旁組織各34例，均來自我院手術(shù)切除標(biāo)本，手術(shù)切除組織立即液氮凍存，腫瘤組織均經(jīng)病理檢查證實(shí)。其中男20例，女14例，平均年齡(58.4±12.1)歲。

1.2 儀器與試劑 ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。TRIpure Reagent購自北京百泰克公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR GreenⅡ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自Fermentas公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測胃癌組織中ACE mRNA的表達(dá)用Trizol法提取胃癌組織及癌旁組織總RNA。以總RNA為模板，按照 Fermentas公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，獲得cDNA。參照文獻(xiàn)〔4〕設(shè)計(jì)ACE引物:上游:5'-CTCAAGTACTTCCAGCCAGTC-3';下游:5'-GCAGAATCTTGCTGGTCTCTG-3'。內(nèi)參GAPDH:上游:5'-GAAGGTGAAGGTCG GAGTC-3';下游:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，引物由上海英俊生物有限公司合成。按照100、101、102、103和104梯度稀釋 cDNA，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析。20 μl反應(yīng)體系中加入cDNA 模版 2.0 μl，SYBR Premix Ex TaqTM(2 × )10.0 μl，上、下游引物(20 pmol/μl)各 0.3 μl，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，去離子水補(bǔ)足 20 μl。反應(yīng)條件:95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)對照，并分別加陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性驗(yàn)證 實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線平滑、峰高而尖，表明無非特異性擴(kuò)增條帶和引物二聚體形成，引物的特異性較好，可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。見圖1。

圖1 ACE基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR溶解曲線

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ACE mRNA表達(dá) ACE mRNA在胃癌組織中表達(dá)(0.94±0.47)顯著高于癌旁組織(0.65±0.42)(P=0.003)。胃癌組織ACE mRNA表達(dá)與分化程度(高中分化為 n=19，0.90±0.47;低分化為 n=15，0.99±0.48)、臨床分期(Ⅰ ～ Ⅱ期 n=17，1.06±0.48;Ⅲ ～ Ⅳ期 n=17，0.82±0.43)和轉(zhuǎn)移狀態(tài)(有轉(zhuǎn)移 n=18，0.96 ±0.42;無轉(zhuǎn)移n=16，0.91±0.52)等臨床病理特征無相關(guān)性(P＞0.05)。

3 討論

ACE是腎素血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，主要作用是催化無活性的血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為增加血管壓力的血管緊張素Ⅱ，此外，也可使緩激肽等血管活性物質(zhì)失活。由于其收縮血管和升高血壓的作用，長期以來作為高血壓和腎臟疾病研究的熱點(diǎn)。近年來，發(fā)現(xiàn)ACE可以影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、血管生成和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為〔1〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均顯示:使用ACE抑制劑具有抑制腫瘤生長、血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)降解和治療惡病質(zhì)的多種作用〔2〕。

研究證實(shí):ACE在多種腫瘤中存在差異性表達(dá)。例如:Rocken等運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測到ACE mRNA在結(jié)腸癌組織的表達(dá)顯著高于其在對應(yīng)的非病變組織表達(dá)〔4〕。國內(nèi)外研究均報(bào)道:血清ACE活性在多種腫瘤，包括胃腸道腫瘤、乳腺癌、肺癌和頭頸癌等明顯低于正常對照組〔5～7〕，并且與轉(zhuǎn)移和預(yù)后等生物學(xué)活性有關(guān)，即有轉(zhuǎn)移的肺癌患者中ACE活性明顯低于未轉(zhuǎn)移者，治療期間患者中ACE活性明顯低于恢復(fù)期患者，ACE活性越低，預(yù)后越差。Carl-McGrath等分別運(yùn)用免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)觀察到ACE蛋白質(zhì)和mRNA在胃癌中明顯高表達(dá)〔3〕。

本研究結(jié)果提示ACE在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮較重要作用。雖然目前尚不清楚其準(zhǔn)確分子機(jī)制，但本研究結(jié)果為今后進(jìn)一步深入研究ACE基因表達(dá)在胃癌發(fā)病機(jī)制中的作用奠定了有利基礎(chǔ)。

1 Deshayes F，Nahmias C.Angiotensin receptors:a new role in cancer〔J〕?Trends Endocrinol Metab，2005;16:293-9.

2 Lever AF，Hole DJ，Gillis CR，et al.Do inhibitors of angiotensin-Ⅰ-converting enzyme protect against risk of cancer〔J〕?Lancet，1998;352:179-84.

3 Carl-McGrath S，Lendeckel U，Ebert M，et al.The ectopeptidases CD10，CD13，CD26，and CD143 are upregulated in gastric cancer〔J〕.Int J Oncol，2004;25:1223-32.

4 Rocken C，Neumann K，Carl-McGrath S，et al.The gene polymorphism of the angiotensinⅠ-converting enzyme correlates with tumor size and patient survival in colorectal cancer patients〔J〕.Neoplasia，2007;9:716-22.

5 Varela A，Saez JBL.Utility of serum activity of angiotensin-converting enzyme as a tumor marker〔J〕.Oncology，1993;50:430-5.

6 劉 虹，裴 彰.血清及支氣管肺泡灌洗液中CA-50，CEA，ACE檢測對肺癌診斷的價(jià)值〔J〕.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998;29(2):134.

7 張 偉.血管緊張素轉(zhuǎn)化酶檢測對肺癌診斷的臨床意義〔J〕.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002;8(3):355-6.