程 欣 馬劉紅 徐建兵 陳 彥 羅煥敏 (暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院組胚系，廣東 廣州 50632)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種與衰老相關(guān)、以認(rèn)知功能下降為特征的漸進(jìn)性腦退行性疾病。AD患者大腦皮質(zhì)彌散性萎縮，神經(jīng)元丟失，突觸減少，細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積形成老年斑(senile plaque，SP)和細(xì)胞內(nèi)tau蛋白異常磷酸化導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle，NFT)形成是其特征性病理變化。由于AD是多因素引起的、涉及多種病理機(jī)制的多因異質(zhì)性疾病，建立精準(zhǔn)復(fù)制AD病理特征和臨床癥狀的動(dòng)物模型有一定困難，從而影響AD的深入研究。模型是評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要依據(jù)，因此，確立合適的AD模型是實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)分別采用側(cè)腦室注射Aβ25-35、AlCl3和海馬物理損傷三種方法復(fù)制出不同的AD小鼠模型，旨在建立并比較這幾種常用模型的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級雌性昆明小鼠90只，體重25.0～30.0 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證2009A022。

1.2 試劑和儀器 Aβ25-35(Sigma，Cat:A4559)。Aβ25-351 mg溶于 100 μl滅菌生理鹽水中，濃度為 10 μg/μl，4℃ 冰箱保存，使用前封口置于37℃孵育96 h。AlCl3(天津市福晨化學(xué)試劑廠)。2.5 g AlCl3溶解于100 ml滅菌生理鹽水中，4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩Ｍ每?β1-40多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒(均Boster)，DAB(福州邁新)。自制針頭(取9號注射針頭，于距針尖1 mm處彎折90°)。通用型Morris水迷宮自動(dòng)實(shí)驗(yàn)記錄儀器(上海吉量公司)，DY-1型腦立體定位儀(天津市醫(yī)療器械研究所)，微量注射器(寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 90只小鼠分6組，每組15只。①正常對照組:動(dòng)物未經(jīng)任何處理。②Aβ25～35損傷模型組:小鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀，暴露前囟，參照小鼠腦立體定位圖譜，每只小鼠右側(cè)腦室注射3 μl Aβ25-35(濃度2 μg/μl);坐標(biāo)為前囟后1.2 mm，矢狀縫右側(cè)旁開1.2 mm，即為側(cè)腦室的體表部位(圖1)，進(jìn)針深度為顱骨表面向下3.2 mm;注射時(shí)進(jìn)針1 μl/min，注射后留針8 min，拔針時(shí)速度為1 mm/min，動(dòng)物清醒后歸籠飼養(yǎng)。③AlCl3損傷模型組:小鼠右側(cè)腦室內(nèi)注射3 μl AlCl3溶液(濃度2.5%)，注射坐標(biāo)、方法同上組。④海馬物理損傷模型組:小鼠固定于腦立體定位儀，坐標(biāo)為前囟后2.4 mm，矢狀縫右旁開2.0 mm，使用自制尖端彎曲的9號針頭垂直插入兩側(cè)海馬，順時(shí)針轉(zhuǎn)一周，進(jìn)針深度為顱骨表面向下3 mm。⑤空白對照組:注射部位、方法同②，注射等體積的無菌生理鹽水。⑥假手術(shù)組:小鼠固定于腦立體定位儀，坐標(biāo)同④，使用自制尖端彎曲的9號針頭垂直插入兩側(cè)皮層，進(jìn)針深度為顱骨表面下1.5 mm，不旋轉(zhuǎn)，插入即拔出(排除皮層損傷對小鼠行為學(xué)的影響)。

1.3.2 行為學(xué)檢測 術(shù)后14 d，水迷宮檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮直徑100 cm、高50 cm，水深30 cm。水溫(24±1)℃。池壁標(biāo)記 E、S、W、N 4個(gè)入水點(diǎn)，在 E、S象限中央、距池壁約30 cm處，放置一高約29 cm、直徑9 cm的水下平臺。測試共5 d，包括:①定位航行試驗(yàn)(place navigation training):將小鼠依次從4個(gè)入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄小鼠從入水至找到并爬上平臺的時(shí)間即逃避潛伏期。測試時(shí)間60 s，上臺15 s后系統(tǒng)自動(dòng)關(guān)閉。60 s內(nèi)小鼠未找到平臺，逃避潛伏期記錄為60 s，隨后將小鼠置于平臺上停留15 s。室內(nèi)安靜、參照物位置固定。完成4個(gè)象限測試為1次，每天上下午各訓(xùn)練1次，連續(xù)4.5 d，統(tǒng)計(jì)第5天上午的逃避潛伏期，逃避潛伏期越短說明其學(xué)習(xí)記憶能力越好。②空間探索試驗(yàn)(spatial probe training):第5天下午撤平臺，將小鼠于S點(diǎn)置于水中，記錄其90 s內(nèi)穿越原平臺所在位置的次數(shù)，穿臺次數(shù)越多說明小鼠學(xué)習(xí)記憶能力越好。

1.3.3 組織學(xué)切片觀察海馬形態(tài) 實(shí)驗(yàn)用小鼠完成水迷宮測試后，4%多聚甲醛灌注固定，取小鼠全腦，后固定24 h后梯度蔗糖脫水，OCT包埋，海馬區(qū)冠狀連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm，每3張取1張裱片，HE染色，觀察各組小鼠海馬結(jié)構(gòu)變化。

圖1 側(cè)腦室注射染料后體視鏡圖(×10)，依此確定側(cè)腦室的體表體置

1.3.4 Aβ1-40免疫組化染色 海馬區(qū)冠狀連續(xù)切片每3張取1張行Aβ免疫組化染色。切片抗原微波修復(fù)10 min，一抗為兔抗 Aβ1-40多克隆抗體(1∶200)，4℃冰箱過夜，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 行為學(xué)檢測結(jié)果用SPSS16.0處理，采用單因素方差分析。方差齊同用LSD檢驗(yàn)各組間顯著性差異，方差不齊用Tamhane's法。數(shù)據(jù)以±s表示，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同造模方法對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表1):與正常對照組、空白對照組和假手術(shù)組比較，海馬物理損傷組小鼠逃避潛伏期顯著延長、穿越平臺次數(shù)明顯減少(P＜0.01)，AlCl3側(cè)腦室注射組小鼠逃避潛伏期也延長、跨越平臺次數(shù)也減少(P＜0.05)，但均不及海馬物理損傷組明顯，Aβ25-35側(cè)腦室注射組小鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)變化不明顯(P＞0.05)。3個(gè)模型組間比較，Aβ25-35注射組小鼠逃避潛伏期和穿臺次數(shù)與海馬物理損傷組和AlCl3注射組均有顯著性差異(P＜0.05)?？梢姾ｑR物理損傷組、側(cè)腦室注射AlCl3組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力受到一定影響，但一次性側(cè)腦室注射Aβ25-35對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶影響不大。側(cè)腦室注射生理鹽水及傷及皮層的物理損傷對小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力無影響。見表1。

2.2 各組小鼠海馬Aβ1-40免疫組化染色結(jié)果 正常對照組、空白對照組、假手術(shù)組和海馬物理損傷模型組小鼠海馬Aβ1-40反應(yīng)均呈陰性;側(cè)腦室注射AlCl3和Aβ25-35模型組的小鼠，在海馬區(qū)和皮層都可見呈Aβ1-40弱陽性反應(yīng)的細(xì)小的棕黃色斑塊，陽性反應(yīng)物積聚在神經(jīng)元胞體和突起的周圍，以星星點(diǎn)點(diǎn)的“彌散狀斑塊”為主，未見較大的陽性斑塊聚集。其中側(cè)腦室注射AlCl3組Aβ1-40陽性物略多。見圖2。

表1 各組小鼠第5天定位航行與空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(± s，n=15)

表1 各組小鼠第5天定位航行與空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(± s，n=15)

與正常對照組、空白對照組和假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;2)P＜0.01;與Aβ25-35側(cè)腦室注射組比較:3)P＜0.05

組別 逃避潛伏期(s) 穿越平臺次數(shù)(次數(shù))正常對照組25.78±3.30 4.87±1.28空白對照組 26.64±2.75 5.11±1.30假手術(shù)組 27.78±4.05 4.46±0.97 Aβ25-35側(cè)腦室注射組 29.38±2.98 4.20±0.70 AlCl3側(cè)腦室注射組 37.52±3.261)3) 1.93±0.771)3)海馬物理損傷模型組 53.23±2.932)3) 1.06±0.592)3)

圖2 各組小鼠海馬Aβ1-40免疫組化染色結(jié)果(×100)

圖3 各組小鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)改變(HE，×200)

2.3 各組小鼠海馬形態(tài)學(xué)變化 如圖3所示，正常對照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體形神經(jīng)元有1～3層，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，層次清晰，排列整齊密集，胞核淺染、核仁清楚。海馬物理損傷模型組小鼠海馬CA1～CA3區(qū)的錐體形神經(jīng)元及DG顆粒神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，CA1區(qū)神經(jīng)元多為單層分布，排列松散，有些部位細(xì)胞層不連續(xù)，細(xì)胞間有空隙。有的細(xì)胞核濃染，出現(xiàn)核固縮，有些細(xì)胞核有水腫。手術(shù)進(jìn)針的皮層表面有組織缺損，針道附近可見較明顯的毛細(xì)血管增生。AlCl3損傷模型組海馬CA1區(qū)形態(tài)介于正常對照組和海馬物理損傷模型組之間，但更接近正常組，神經(jīng)元排列較整齊，有些部位偶見細(xì)胞稀疏、核固縮、核內(nèi)染色體邊集等現(xiàn)象。側(cè)腦室注射Aβ25-35模型組海馬區(qū)結(jié)構(gòu)與正常對照組差異不明顯，有些部位神經(jīng)元層次結(jié)構(gòu)松散。空白對照組和假手術(shù)組小鼠海馬形態(tài)同正常對照組無差異，假手術(shù)組小鼠皮層表面尚見淺凹形缺損。

3 討論

理想的AD模型應(yīng)具備以下條件:①記憶和認(rèn)知功能障礙;②能復(fù)制引起損傷的病理特點(diǎn):SP、NFT及神經(jīng)元丟失;③膽堿能系統(tǒng)功能低下。一個(gè)動(dòng)物模型如能反映出上述3個(gè)方面，可認(rèn)為是成功的AD動(dòng)物模型。動(dòng)物模型是藥物研究的前提，選擇合適的模型對藥物臨床前研究的成敗至關(guān)重要。目前常把學(xué)習(xí)和記憶障礙的動(dòng)物模型作為AD的動(dòng)物模型。

Aβ是SP的主要成分，但Aβ注射制作AD模型的可行性報(bào)道差別較大。Aβ常見注射部位有Meynert核、海馬等，造模方式有一次性注射致急性中毒和持續(xù)性注射致慢性中毒〔1～4〕?；贏D是腦組織彌漫性損傷性疾病，經(jīng)側(cè)腦室給予更利于Aβ彌散而造成較大范圍的損害，同時(shí)依據(jù)Aβ神經(jīng)毒性的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用Aβ核心毒性片斷25-35肽段側(cè)腦室注射制作AD模型。結(jié)果顯示Aβ25-35一次性側(cè)腦室注射后第3周末，小鼠穿越平臺次數(shù)和逃避潛伏期與對照組均無明顯差異，即對小鼠記憶能力無影響。此與上述文獻(xiàn)結(jié)果有差異，究其原因可能與Aβ蛋白的活性受溫度、pH、濃度、分子構(gòu)象等多因素影響有關(guān);并且本實(shí)驗(yàn)選用Aβ25-35，有可能因片段較短致使毒性降低而損傷較輕。由于小鼠機(jī)體本身存在自凈和修復(fù)作用，一次性給予Aβ有可能可制備記憶損傷模型，但損傷持續(xù)時(shí)間較短，且未形成明顯形態(tài)學(xué)改變。因此，支持Aβ注射造模需多次注射的觀點(diǎn)，如多次給藥一般需要埋管處理，顯著增加造模難度和成本。

鋁毒性作用在AD形成中引起高度關(guān)注。流行病學(xué)資料顯示:長期高鋁暴露致認(rèn)知能力下降，尸檢結(jié)果也發(fā)現(xiàn)AD患者大腦中Al含量為正常人的1.5～3.0倍，提示Al和AD發(fā)病的潛在關(guān)聯(lián)〔5〕。慢性鋁中毒可導(dǎo)致小鼠神經(jīng)原纖維變性，出現(xiàn)膽堿能系統(tǒng)損傷癥狀，大腦皮質(zhì)萎縮、端腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元損傷丟失等，這些變化與AD病理改變有一定相似性〔6〕。慢性鋁中毒致AD模型多采用腹腔或皮下注射，鑒于經(jīng)驗(yàn)，長期腹腔或皮下注射易感染，反復(fù)灌胃給藥也易引發(fā)胃黏膜損傷嚴(yán)重甚至穿孔，同時(shí)影響動(dòng)物食欲致體重明顯降低，故本實(shí)驗(yàn)采用了側(cè)腦室一次性注射AlCl3的方法。文獻(xiàn)報(bào)道鋁積聚激活反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，引發(fā)炎性反應(yīng)，促使Aβ以不溶形式沉積于腦組織，形成老年斑〔7〕。本實(shí)驗(yàn)觀察到造模后小鼠海馬和皮層呈Aβ1-40免疫組化陽性反應(yīng)，而Aβ1-40是老年斑的主要成分，與報(bào)道一致;另有研究表明鋁可與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，改變該蛋白結(jié)構(gòu)，影響鈣調(diào)蛋白依賴的各種蛋白激酶活性，從而影響體內(nèi)磷酸化和去磷酸化的過程及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如PKC異常激活導(dǎo)致tau蛋白異常磷酸化〔8〕，因此本模型能較好地模擬AD的特征性病理改變。該模型的優(yōu)點(diǎn)有:①模擬AD程度高，造模成功率高;②價(jià)格低廉，造模成本低。缺點(diǎn)在于:由于酸堿度、AlCl3的神經(jīng)毒性等原因，動(dòng)物體重下降明顯。

1970年代人們發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)Ach含量低于正常水平，提出膽堿能缺陷學(xué)說，認(rèn)為突觸末端膽堿能缺損是導(dǎo)致記憶障礙的主要原因之一。Meynert核是前腦皮層Ach的重要來源，其產(chǎn)生的Ach經(jīng)穹窿轉(zhuǎn)移至海馬被利用，而海馬在維持記憶方面扮演重要角色。針對這條通路產(chǎn)生各種記憶損傷模型，如真空抽吸、橫斷、電灼傷等物理方法。Xuan等〔9〕在前囟定位后插進(jìn)刀片并反復(fù)抽提，離斷SD大鼠一側(cè)穹窿-海馬傘外側(cè)緣纖維，復(fù)制出癡呆大鼠模型。筆者在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇對結(jié)果有一定影響，應(yīng)用該方法制備小鼠AD模型，操作中因橫切抽動(dòng)出血量大，術(shù)后動(dòng)物死亡率高、造模成功率低;同時(shí)很難保持每次提拉刀片時(shí)進(jìn)刀角度和深度一致，極易損傷周邊腦組織。此法造模后行為學(xué)測試結(jié)果確有記憶減退，但難以說明完全是由損傷膽堿能通路所致。針對這點(diǎn)，筆者采取旋轉(zhuǎn)的辦法特異性地破壞海馬組織，操作中容易定位，損傷強(qiáng)度和范圍相對易于控制，小鼠術(shù)后存活率高。與上述2種化學(xué)損傷模型相比，物理損傷模型的優(yōu)勢在于:①造模時(shí)間短，記憶下降明顯，持續(xù)時(shí)間久;②造模成本低;③損傷機(jī)制清楚;④無藥物殘留，若用于藥物治療研究，不會造成造模藥物與治療藥物相互影響，造模后短時(shí)間內(nèi)即可給藥。劣勢有:①損傷局限，無全腦彌漫性損傷，模擬AD程度低，無特征性病理改變形成;②操作難度大，損傷范圍有時(shí)不易控制;③水迷宮中發(fā)現(xiàn)物理損傷后不游泳或游泳不靈活小鼠增加，可能與術(shù)后未完全康復(fù)有關(guān)。

因AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前所有動(dòng)物模型只能模擬其部分特征，且各種模型雖均可使動(dòng)物記憶下降或出現(xiàn)行為學(xué)改變，機(jī)制卻不盡相同。多因素復(fù)合損傷制作的AD模型，同樣存在技術(shù)復(fù)雜、損傷機(jī)制不甚清楚等缺陷。研究AD模型的意義是為探明其發(fā)病機(jī)制和藥物治療提供平臺，本實(shí)驗(yàn)使用的3種造模方法，旨在制作急性記憶下降的模型，可用于研究急性或亞急性指標(biāo)的改變，或用于AD的預(yù)防給藥及治療藥物的臨床前研究。在不同的實(shí)驗(yàn)研究中，只有選擇最合適的模型，才可達(dá)到事半功倍的效果。

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