周小平，馬艷紅，傅延齡

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

營衛(wèi)具有“熏膚、充身、澤毛、溫分肉、充皮膚、肥腠理、司開合”的作用，與皮膚生理病理有十分密切的關(guān)系。營衛(wèi)的盛衰是影響皮膚狀態(tài)的重要因素，因此研究營衛(wèi)與皮膚衰老間的關(guān)系具有理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康4月齡昆明種小鼠120只，清潔級(jí)，雌雄兼用，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。各組小鼠在相同條件下自由攝食、飲水，保持自然光照。

1.2 藥物

補(bǔ)益營衛(wèi)藥物由人參、甘草等組成，藥物購自本校國醫(yī)堂，為同仁堂優(yōu)質(zhì)飲片。由本校藥學(xué)系中藥制備教研室加工、濃縮成4g/ml（每毫升含4g生藥）的浸膏，避光4℃冷藏備用，灌胃時(shí)用生理鹽水配成所需濃度。設(shè)維生素E為陽性對(duì)照藥，購自市售藥店。

1.3 造模及給藥方法

1.3.1 分組造模 把120只4月齡昆明種小鼠雌雄分開，每性別小鼠體質(zhì)量均衡隨機(jī)各分為6組，每組10只，分別設(shè)為正常組、模型組、陽性對(duì)照組、補(bǔ)益營衛(wèi)高劑量組、中劑量組和低劑量組。正常組常規(guī)進(jìn)食飲水及光照。其他各組參照文獻(xiàn)法［1］按120mg/kg體質(zhì)量每日背部皮下注射 D-半乳糖，每周禁食稱重1次。

1.3.2 給藥 造模同時(shí)模型組每日灌服生理鹽水，陽性對(duì)照組每日灌服維生素 E 50mg/kg，補(bǔ)益營衛(wèi)高、中、低劑量組按（生藥/體質(zhì)量）8g/kg、4g/kg、2g/kg灌胃，連續(xù) 6 周。

1.4 取材方法

第7周處死動(dòng)物前1d，動(dòng)物用10％硫化鈉溶液脫去兩肩胛至兩髂骨之間背部皮膚的毛，第2天用10％水合氯醛按3.5ml/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取全血放入肝素鈉管中，低溫離心機(jī)3500rpm，離心20min取上清冷藏待測。分離血清后的紅細(xì)胞沉淀用0.9％生理鹽水3500rpm，離心洗滌2次，－80℃凍存待測。剪下背部脫毛皮膚鋪平，用直徑1.4cm的打孔器取下兩塊皮膚，除去皮下組織適當(dāng)剪碎，先用電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，顯微鏡下觀察，勻漿不充分者再用手動(dòng)使勻漿充分，濃度為10％，勻漿過程均須在冰水中進(jìn)行。取材時(shí)剪取頸部皮膚，置4％中性多聚甲醛溶液中固定，1周后換溶液1次。24h后常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟和包埋。

1.5 主要儀器

AE160型電子分析天平，DDL-5型低溫離心機(jī)，Bio-RAD680酶標(biāo)比色儀，全自動(dòng)石蠟切片機(jī)，Olympus光學(xué)顯微鏡，臺(tái)式水浴恒溫振蕩器SHZ-88等。

1.6 主要試劑

多聚甲醛、無水乙醇等分析純購自北京化學(xué)試劑公司。兔抗鼠 bFGF多克隆抗體、黃色 DAB顯色劑、山羊抗兔 IgG-抗體-HRP多聚體、牛血清白蛋白（BSA）均購自北京中山金橋生物工程有限公司。復(fù)合消化液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測bFGF的表達(dá)

5μm石蠟切片脫臘、水化，3％H2O2室溫孵育10min，PBS洗 3min ×3，去離子水洗 2min，3％H2O2室溫孵育 10min，0.01M PBS洗 3次，每次 3min，滴加復(fù)合消化酶，37℃ 修復(fù) 20min，0.01M PBS洗 3次，每次3min，牛血清白蛋白室溫封閉 20min傾棄，滴加 1∶100兔抗鼠 bFGF多克隆抗體，4℃過夜，0.01M PBS洗 3次，每次 5min，滴加山羊抗兔 IgG-抗體-HRP多聚體，37℃30min，0.01M PBS洗 3次，每次5min，滴加黃色 DAB室溫顯色5min，去離子水洗中止反應(yīng)，脫水、透明、中性樹膠封片。每組染色均設(shè)以PBS液代替一抗的陰性對(duì)照。必要時(shí)去離子水洗中止反應(yīng)后蘇木素襯染，脫水、透明、中性樹膠封片。

通過安裝在 B×51正置熒光顯微鏡上的照相系統(tǒng)以及計(jì)算機(jī)Image-pro plus 5.1圖像分析軟件對(duì)bFGF免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果進(jìn)行拍照和分析。拍照時(shí)每劑量組顯色組織切片20倍物鏡下隨機(jī)選取18處視野進(jìn)行拍照存檔，測量時(shí)用Image-pro plus 5.1圖像分析軟件以統(tǒng)一的光密度（Density，簡稱為 D）閾值作為測量指標(biāo)，以光密度值平均值的高低作為衡量各組皮膚bFGF蛋白表達(dá)的尺度。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)資料均采用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（珋x±s）表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后用t檢驗(yàn)進(jìn)行多組均數(shù)的兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 bFGF蛋白的表達(dá)部位

正常小鼠皮膚表達(dá)bFGF的陽性細(xì)胞主要為表皮細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞、毛囊和汗腺上皮細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。在表皮細(xì)胞、毛囊和汗腺上皮細(xì)胞胞漿、皮脂腺細(xì)胞胞核強(qiáng)表達(dá)；成纖維細(xì)胞表達(dá)較弱，表現(xiàn)為棕黃色顆粒（見圖1A）。造模后，bFGF在上述部位表達(dá)均減弱，表現(xiàn)為淡黃色顯色（見圖1B）。給與維生素 E及補(bǔ)益營衛(wèi)處理后，上述部位bFGF表達(dá)明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為棕褐色顯色顆粒（見圖1C、D、E、F）。陰性對(duì)照所有皮膚結(jié)構(gòu)均未見陽性顯色。

2.2 免疫組織化學(xué)方法分析bFGF蛋白在各組小鼠皮膚的表達(dá)

表1顯示，造模后bFGF表達(dá)水平顯著降低，與正常組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。補(bǔ)益營衛(wèi)處理后，高劑量組 bFGF水平顯著增加，與正常組，模型組、VE組、低劑量組相比均有顯著性差異，分別為 P＜0.05，P ＜0.001，P ＜0.05和，P ＜0.05。中、低劑量組、VE組均使下降的 bFGF基本恢復(fù)至正常水平，高劑量組蛋白含量與陽性相比增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表1 補(bǔ)益營衛(wèi)對(duì)小鼠皮膚bFGF蛋白表達(dá)的影響

3 討論

《傷寒論·平脈法》58條中說：“寸口脈緩而遲，緩則陽氣長，其色鮮，其顏光，其聲商，毛發(fā)長；遲則陰氣盛，骨髓生，血滿，肌肉緊薄鮮硬。陰陽相抱，榮衛(wèi)俱行，剛?cè)嵯嗟?，名曰?qiáng)也?！痹诘?9條說：“寸口脈微而澀，微者衛(wèi)氣衰，澀者榮氣不足，衛(wèi)氣衰，面色黃，榮氣不足，面色青。榮為根，衛(wèi)為葉，榮衛(wèi)俱微，則根葉枯槁……”指出營衛(wèi)充盛，則肌肉健壯，容光煥發(fā)，沒有衰老之象；反之，營衛(wèi)不足，則面色青黃，衰象顯露。堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factors，bFGF）是一種多功能的細(xì)胞因子，具有多種生物活性，可誘導(dǎo)大多數(shù)來自中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞的有絲分裂，在胚胎形成、血管新生、神經(jīng)營養(yǎng)和創(chuàng)傷愈合中起重要作用［2］，也與創(chuàng)面愈合和組織修復(fù)密切相關(guān)［3、4］。bFGF常通過旁分泌或自分泌機(jī)制在皮膚組織中發(fā)揮重要生理功能。研究結(jié)果表明，bFGF及其受體在胎兒和成人皮膚組織中都有陽性表達(dá)，且它們的表達(dá)量隨著皮膚組織的不斷成熟而逐漸增大，表明皮膚的生長發(fā)育、表型和功能的維持以及損傷后的修復(fù)可能都需要bFGF參與，并且內(nèi)源性 bFGF可能是皮膚修復(fù)與再生的重要內(nèi)源性調(diào)控因子［5］。bFGF的這些功能與營衛(wèi)“充皮膚，肥腠理”的功能之間存在共性。衰老時(shí)皮膚膠原合成減少，彈性降低，血管生成減少，密度降低，可能與bFGF之間存在內(nèi)在聯(lián)系，也與營衛(wèi)之間存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)。

圖1 小鼠皮膚組織bFGF免疫組化顯色（DAB 10×20）

我們在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)益營衛(wèi)能夠增加衰老皮膚中減少的膠原水平。本試驗(yàn)進(jìn)一步的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮膚衰老模型中 bFGF表達(dá)減少，與正常小鼠皮膚相比有顯著差異，提示 bFGF表達(dá)減少與衰老皮膚膠原減少有內(nèi)在聯(lián)系。補(bǔ)益營衛(wèi)處理后，bFGF的表達(dá)增加，尤其是高劑量組，與其他組包括陽性對(duì)照組維生素E組相比都有顯著差異，說明補(bǔ)益營衛(wèi)處理增加膠原合成的一個(gè)重要途徑是通過bFGF實(shí)現(xiàn)的，也是補(bǔ)益營衛(wèi)延緩皮膚衰老的重要原因之一。

［1］HalliwellB，Gutteridge JMC.Free radieals in biology and medicine［M］.3rded，Newyork：Oxford University Press，1999.617.

［2］Aigner A，Ray PE，Czubayko F，etal.Immunolocalization of an FGF-binding protein rev-eals a widespread expression pattern during different stages of mouse embryo devel-opment［J］.Histochem Cell Biol，2002，117（1）：1-11.

［3］Nakada T，Saito Y，Chikenji M，etal.Therapeutic outcome of hyperbaric oxygen and basic fibroblast growth factor on intractable skin ulcer in legs：preliminary report［J］. Plast Rec-onstr Surg，2006，117（2）：646-651.

［4］Akita S，Akino K，Imaizumi T，Hirano A.A basic fibroblast growth factor improved the quality of skin grafting in burn patients［J］.Burns，2005，31（7）：855-858.

［5］陳 偉，付小兵，孫同柱，等.堿性成纖維生長因子及其受體在胎兒和成人皮膚內(nèi)的表達(dá)特征及其意義［J］.中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2002，14（7）：400-403.