譚 勇，李 健，呂 誠，肖 誠，許少華，楊 靜，趙宏艷，鞠大宏，呂愛平△

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體形態(tài)系，北京 100029；3.衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院科研處，北京 100029；

4.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700）

既往的研究表明，氫化可的松腎陽虛證模型能夠較好地模擬臨床腎陽虛證狀態(tài)［1］；白附片可導(dǎo)致健康大鼠和腎陽虛模型大鼠血清和心臟組織中酶學(xué)的異常改變，隨著白附片使用的增加，異常程度加重，且與健康大鼠相比，腎陽虛模型大鼠酶學(xué)異常改變程度較輕［2-3］。為進(jìn)一步探索白附片醇提物對健康大鼠和腎陽虛模型大鼠的心臟毒性差異，本研究通過心電圖和心臟組織病理觀察白附片的心臟毒性，從而為基于中醫(yī)對證動(dòng)物模型評價(jià)中藥毒性的合理性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用SPF級雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量180g～200g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供（合格證號 SCXK-（軍）2007-004）。

1.1.2 藥物 造模用藥注射用氫化可的松琥珀酸鈉（天津生物化學(xué)制藥有限公司，生產(chǎn)批號20080604），用生理鹽水配成濃度為 71.43mg/ml的溶液；灌胃給藥：白附片（北京燕京飲片廠，生產(chǎn)批號081117，產(chǎn)地四川）用乙醇提取制成 2g生藥/ml的溶液（由中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所方證研究中心提?。?。

1.1.3 儀器 MP-100型生理實(shí)驗(yàn)信號采集分析系統(tǒng)（美國 BloAP公司），光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立和分組 80只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后隨機(jī)分為2組（健康組和模型組）各40只。模型組和健康組中的每只動(dòng)物每天上午在臀部肌肉豐厚處各自注射0.5ml/kg的氫化可的松琥珀酸鈉溶液和生理鹽水溶液，連續(xù) 9d。然后，再把2組動(dòng)物分別隨機(jī)分為低劑量、小劑量、中劑量和大劑量4個(gè)給藥組和空白對照組，每組8只。

1.2.2 給藥方法 分組當(dāng)天對給藥組和空白對照組大鼠分別灌胃給予10ml/kg的白附片溶液和生理鹽水，每天1次，連續(xù)14d。給藥組給藥濃度從低到高依次為：0.32g/kg、0.64g/kg、1.28 g/kg 和 2.56 g/kg。

1.2.3 取材 給藥結(jié)束后，所有大鼠稱重并于麻醉狀態(tài)下采用頸椎脫臼法處死，迅速取出完整心臟稱取濕重，然后切取部分心臟組織浸入4％的甲醛溶液固定。

1.2.4 心電圖檢測 在大鼠給藥的第12天以腹腔注射3％戊巴比妥鈉0.10 ml/100g質(zhì)量麻醉大鼠后，使其平躺俯臥于平板上，以 Biopac MP多道生理記錄儀描記Ⅱ?qū)?lián)心電圖，記錄心率（BPM）和峰-峰值（P-P）以及心律失常情況。

1.2.5 組織病理學(xué)觀察 固定后的心臟組織行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片及 HE染色，光鏡觀察并攝片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

劑量資料，組內(nèi)各劑量處理組間比較采用單因素方差分析，組間采用廣義線性模型兩因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)精確概率法和Logistic回歸分析，顯著性水平取 P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 造模及白附片給藥對大鼠行為形態(tài)的影響

造模致使大鼠精神萎靡、瞇眼、嗜睡，蜷縮、扎堆，對聲音、觸動(dòng)刺激反應(yīng)遲鈍，以及出現(xiàn)毛聳而臟、失去光澤的表現(xiàn)。給藥致使大鼠不安走動(dòng)，易激惹，雙目、口唇紅赤，飲食減少，呼吸急促，模型大鼠的反應(yīng)較輕。

2.2 白附片對 BPM和 P-P的影響

表1顯示，健康組和腎陽虛證組各組內(nèi)比較，2組 BPM在給藥劑量為0.64 g/kg時(shí)，與各自空白組比較，BPM增大，有顯著性差異（P＜0.05），并隨著劑量的加大，BPM增大的趨勢更明顯，有非常顯著性差異（P＜0.01）；2組 P-P在給藥劑量為 0.32 g/kg時(shí)，與各自空白組比較，P-P增大，有顯著性差異（P＜0.05），亦隨著劑量的加大，P-P增大的趨勢更明顯，也有非常顯著性差異（P＜0.01）。健康組與腎陽虛證組組間比較，BPM和 P-P隨著劑量變化在2組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與腎陽虛組 BPM比較，健康組BPM隨著劑量增加而增大的幅度更大。

表1 不同劑量白附片對健康和腎陽虛大鼠BPM和P-P的影響比較±sd）

表1 不同劑量白附片對健康和腎陽虛大鼠BPM和P-P的影響比較±sd）

注：各組內(nèi)比較，與健康空白組比較：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與腎陽虛證空白組比較：▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

檢測指標(biāo) 組 別白附片劑量（g/kg）統(tǒng)計(jì)結(jié)果0 0.32 0.64 1.28 2.56 檢驗(yàn)參數(shù)F P BPM（B） 健康組 379.50 ±36.71 406.00 ±38.24 423.63 ±17.70*436.13 ±19.93＊＊453.88 ±20.39＊＊ 模型檢驗(yàn)19.78 0主效應(yīng)：劑量 54.23 0模型組 387.63 ±10.88 403.14 ±20.28 417.57 ±18.72▲ 424.57 ±14.47▲ 433.25 ±13.13▲▲ 主效應(yīng)：組別 0.15 0.698交互效應(yīng) 3.15 0.080 P-P（V） 健康組 0.34 ±0.14 0.49 ±0.09* 0.68 ±0.16* 1.21 ±0.69＊＊ 1.29 ±0.42＊＊ 廣義線性模型19.81 0主效應(yīng)：劑量 58.80 0模型組 0.32±0.14 0.55±0.27▲ 0.99±0.59▲▲ 0.85±0.29▲▲ 1.58±0.65▲▲ 主效應(yīng)：組別 0.02 0.897交互效應(yīng)0.38 0.541

2.3 白附片對心律的影響

圖2顯示，白附片對大鼠心律有顯著影響，其影響主要表現(xiàn)為室性早搏、心動(dòng)過速等（Ⅱ?qū)?lián)記錄時(shí)間間隔4 s）。表2顯示，對2組各劑量心律失常數(shù)量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，不同劑量給藥對心律影響不同，劑量越大，心率失常發(fā)生率越高；2組間心律失常發(fā)生率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與腎陽虛大鼠比較，健康組大鼠心律失常發(fā)生率隨著劑量增加而增大的幅度更大。

2.4 白附片對心臟組織形態(tài)的影響

圖4顯示，正常心肌著色均勻，肌纖維粗細(xì)大小較一致，肌核清晰可見，肌膜及間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量未見增多，心肌肌漿內(nèi)未見有粉染粗大顆粒、肌漿凝聚或肌漿溶解，間質(zhì)內(nèi)也未見炎細(xì)胞浸潤及瘢痕組織形成，間質(zhì)血管走行及形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常。給藥劑量為0.32 g/kg時(shí)，2組心臟組織無病理形態(tài)學(xué)改變；給藥劑量為0.64 g/kg時(shí)，健康組心肌著色不均，可見心肌血管擴(kuò)張充血，模型組心肌纖維波浪樣走行，偶見有空泡樣變性；給藥劑量為 1.28g/kg時(shí)，健康組心肌著色不均，有處可見心肌纖維波浪樣走行及心肌纖維消失，其內(nèi)伴有淋巴細(xì)胞浸潤，模型組心肌間隔增寬、水腫、血管擴(kuò)張充血；給藥劑量為2.56 g/kg時(shí)，健康組心肌著色不均，伴有肌漿溶解、血管擴(kuò)張充血、心肌間隔增寬、水腫，伴有散在的淋巴細(xì)胞浸潤，有處可見灶狀心肌出血、肌纖維消失，其內(nèi)伴有單核、中性粒細(xì)胞浸潤，模型組心肌著色不均，血管擴(kuò)張充血，有處可見灶狀心肌出血。

表2 不同劑量白附片引起健康和腎陽虛大鼠心率失常情況比較

圖4 大鼠心臟組織形態(tài)學(xué)改變

3 討論

治療作用與不良反應(yīng)是藥物本身所固有的兩重性作用，強(qiáng)烈的不良反應(yīng)表現(xiàn)為藥物的毒性。產(chǎn)生毒性的原因是藥物選擇性作用差、作用所涉及的范圍廣泛。當(dāng)其某一效應(yīng)被用作治療目的時(shí)，其他效應(yīng)就有可能成為毒性作用。機(jī)體的生理病理狀況、性別、年齡、遺傳因素、用藥劑量、用藥時(shí)間、藥物相互作用、環(huán)境因素以及機(jī)體的自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定情況均可影響藥物毒性反應(yīng)的發(fā)生［4］。因此，臨床治療疾病必須充分考慮用藥的安全性和有效性，根據(jù)治療需要權(quán)衡利弊，決定取舍，才能有效地避免藥物的毒性反應(yīng)。

中醫(yī)有“有故無殞”的臨床用藥理論。這個(gè)理論闡述的實(shí)質(zhì)是：只要針對適應(yīng)證，藥物的不良反應(yīng)甚或毒性反應(yīng)會(huì)降低?！搬槍m應(yīng)證”，對中醫(yī)而言就是對證，藥證相應(yīng)是避免中藥毒性反應(yīng)的必要條件。而目前多采用健康動(dòng)物評價(jià)中藥的毒性，這與中醫(yī)臨床實(shí)踐不相符。因此，所得的評價(jià)結(jié)果不足以充分、合理地說明中藥的毒性。鑒于此，我們提出“在對證狀態(tài)下評價(jià)中藥毒性”的假說。藥物的毒性評價(jià)主要包括臨床前和臨床中兩方面的評價(jià)，其中臨床前評價(jià)是前提和基礎(chǔ)。臨床前評價(jià)是主要基于各種動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索藥物的毒性以及毒性機(jī)理的過程。因此，我們首先通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來印證假說。

白附片為毛茛科多年生草本植物烏頭的子根加工品。其性剛烈迅捷，走而不守，通上達(dá)下，行表徹里，有上助心陽、中溫脾陽、下補(bǔ)腎陽之殊功，被譽(yù)為“回陽救逆第一品藥”。雖然白附片有獨(dú)特、迅捷的療效，但強(qiáng)烈的毒性反應(yīng)限制它在臨床上的廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)代研究表明，白附片中的雙酯二萜生物堿具有心臟毒性，心律失常是最典型的表現(xiàn)，以頻發(fā)室早最常見，且為多源性，并易形成二聯(lián)律及陣發(fā)性室速、扭轉(zhuǎn)型室速，甚至發(fā)展為室顫［5］。毒性病理學(xué)評價(jià)是藥物臨床前毒性評價(jià)中最基本的環(huán)節(jié)，觀察病理形態(tài)學(xué)改變是評價(jià)毒性的金指標(biāo)［6］。既往有研究表明，白附片可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，使心肌細(xì)胞肌原纖維溶解、斷裂，線粒體增生，肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，閏盤扭曲，膜斷裂［7、8］。鑒于白附片具有明確療效和典型毒性反應(yīng)以及現(xiàn)代研究基礎(chǔ)，我們選擇白附片作為研究對象，重點(diǎn)研究心臟毒性，把觀察心律失常情況和心臟組織病理形態(tài)學(xué)改變作為觀測的重點(diǎn)，探索其對健康和腎陽虛對證模型大鼠心臟毒性差異，以印證假說。

本研究結(jié)果表明，白附片導(dǎo)致健康和模型大鼠BPM和P-P增大以及心律失常，這與白附片使迷走神經(jīng)興奮、心肌細(xì)胞鈉鈣通道障礙、心臟電位紊亂等有關(guān)［9-11］。隨著白附片劑量的增加，健康和模型大鼠BPM、P-P和心律失常的程度加重，顯示出顯著的劑量依賴性。雖然2組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是與模型大鼠比較，卻表現(xiàn)出健康大鼠心電圖異常程度更重的趨勢。若下一步研究加大樣本量，可能出現(xiàn)2組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。心臟組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，白附片致使健康和模型大鼠心臟病理損傷也存在劑量依賴性，病損程度隨著劑量的增加而加重，且同一給藥劑量時(shí)，2種大鼠心臟病理改變存在明顯的差異，模型大鼠病理改變相對較輕?？傊陨辖Y(jié)果為“白附片對腎陽虛證大鼠的心臟毒性低于健康大鼠的心臟毒性”假設(shè)提供了一定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

結(jié)合我們以往的研究結(jié)果可以推論，針對對證動(dòng)物模型，有毒中藥的毒性反應(yīng)相對較小。這不僅證明證候作為一種機(jī)體狀態(tài)，是影響藥物是否產(chǎn)生毒性的重要因素，而且說明在對證狀態(tài)下才能全面、準(zhǔn)確地評價(jià)中藥的毒性。既往的研究發(fā)現(xiàn)了“基于中醫(yī)證候理論評價(jià)中藥毒性”的合理性，但這僅僅說明了一種客觀存在的現(xiàn)象，其科學(xué)基礎(chǔ)何在，有待進(jìn)一步深入探討。中藥具有多成分、多方向和作用多靶點(diǎn)的特點(diǎn)［12］，證候呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)、多維的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系［13］，因此在對證狀態(tài)下評價(jià)中藥的毒性機(jī)制，必然要采用系統(tǒng)、網(wǎng)絡(luò)化的方法。現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展為中藥毒性的深入研究提供了新技術(shù)和新方法，采用組學(xué)、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)信息學(xué)、數(shù)據(jù)挖掘等新興的交叉學(xué)科技術(shù)，發(fā)掘、優(yōu)化和完善評價(jià)方法，全方位探索中藥的毒性及其內(nèi)在機(jī)制，不僅將推動(dòng)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化，也將為現(xiàn)代藥物研究提供新思路。

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△同等貢獻(xiàn)作者