胡躍強(qiáng)，唐 農(nóng)，雷龍鳴，祝美珍，畢方方，胡玉英，陳 煒

（1.廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南寧 530023；2.廣西中醫(yī)學(xué)院經(jīng)典中醫(yī)研究所，

南寧 530001；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，長(zhǎng)沙 410008）

腦缺血所造成的神經(jīng)功能缺失一直為臨床治療的難點(diǎn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元不可再生的觀念被打破后，腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的移植、分化方面的研究成為當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，這也為NSCs移植治療腦缺血損傷提供了可能。本研究通過(guò)觀察鼠NSCs移植治療腦缺血大鼠的效果及清熱化瘀方的影響，探討該方的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、B27、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、5-溴脫氧尿苷（BrdU）均為 Sigma公司產(chǎn)品；小鼠抗 BrdU單克隆抗體（Chemicon，USA）及兔抗nestin單克隆抗體（Pharmingen公司）；兔抗神經(jīng)絲蛋白200（NF200）多克隆抗體（Santa Cruz，USA）；熒光素Cy3標(biāo)記的兔抗IgG和FITC標(biāo)記的羊抗IgG（北京中山）。

1.1.2 藥物 清熱化瘀方由水牛角30g、丹參15g、赤芍 15g、地龍 10g、石菖蒲 10g等中藥組成，單味中藥濃縮顆粒劑由江蘇省江陰市江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的培養(yǎng) 取新生3d SD大鼠，用75％酒精浸泡30min后斷頭處死取出大腦，分離海馬，機(jī)械分離組織成單細(xì)胞，細(xì)胞以105/ml種入平皿，培養(yǎng)基用 DMEM/F12加 B27、bFGF（20ng/ml）和EGF（20ng/ml），2d更換半量培養(yǎng)基，10d左右用機(jī)械消化法進(jìn)行傳代。將誘導(dǎo)擴(kuò)增后的NSCs以105/ml種于0.1％明膠包埋的平皿中，放入含 5％CO2的培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理 SD大鼠100只，重200g～250g，隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）、干細(xì)胞移植組（C組）、干細(xì)胞移植 +清熱化瘀組（D組），每組25只大鼠，各組按處死時(shí)間分為術(shù)后第 2、4、7、14、28天 5個(gè)亞組，每個(gè)亞組 5只動(dòng)物。A組：線栓只插入頸內(nèi)動(dòng)脈9mm；B組：動(dòng)物造模后2h灌胃同清熱化瘀組等體積的蒸餾水，并給予側(cè)腦室注射等量生理鹽水；C組：大鼠在模型制作成功24h后進(jìn)行 NSCs移植；D組：動(dòng)物造模后，清熱化瘀湯14g/（kg·d）灌胃（按體表面積計(jì)算為臨床70kg成人劑量的3倍），各組動(dòng)物均在術(shù)前6h灌胃1次，在手術(shù)清醒后開(kāi)始灌胃，每天 1次，每次 1.4m1/100g大鼠，余同 C組。

1.2.3 動(dòng)物造模 參照 Longa＇s線栓法阻斷左側(cè)大腦中動(dòng)脈（MCAO）制備局灶性腦缺血模型。

1.2.4 NSCs移植 大鼠在腦缺血模型制作成功24h后進(jìn)行NSCs移植。移植前NSCs經(jīng) Brdu（濃度5μmol/l）標(biāo)記 2d，離心后將其溶解于生理鹽水中，細(xì)胞濃度調(diào)整為 6×105/ml。參照文獻(xiàn)方法［1］，將大鼠麻醉、固定，缺血側(cè)側(cè)腦室處（前囟左側(cè)旁1.5mm，前囟后 1.0mm）頭皮針垂直進(jìn)針，在進(jìn)入5.6 mm后各緩慢推入 10μl細(xì)胞懸液，留針 10min后緩慢拔針。

1.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分（NSS）

參照 Chen 等［2］方法，分別于移植后第 2、4、7、14、28天對(duì)大鼠進(jìn)行 NSS，主要觀察其運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能、平衡能力及生理反射能力；總分為18分，正常為0分，分值越高示其神經(jīng)損害程度越嚴(yán)重。

1.4 組織處理

將大鼠常規(guī)麻醉后，經(jīng)左心室先后用生理鹽水和4％的多聚甲醛進(jìn)行灌注。然后取腦組織固定、脫水、石蠟包埋，按4μm厚度連續(xù)切片。

1.5 神經(jīng)干細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用免疫組化ABC法。石蠟切片以1％H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加正常山羊血清封閉液室溫下孵育 30min，接著分別滴加 1∶100稀釋的小鼠抗nestin單克隆抗體和兔抗 BrdU單克隆抗體，4℃過(guò)夜，然后以 PBS洗滌。再滴加 1∶100的二抗生物素化兔 IgG，PBS沖洗。陰性對(duì)照用正常羊血清代替一抗。

1.6 新生神經(jīng)元檢測(cè)

采用熒光雙標(biāo)免疫組化法檢測(cè)BrdU和NF200表達(dá)雙陽(yáng)性細(xì)胞為新生神經(jīng)元，小鼠抗 BrdU抗體（1∶100）以 Cy3標(biāo)記，兔抗 NF200抗體以 FITC標(biāo)記。被標(biāo)記新生神經(jīng)細(xì)胞同時(shí)發(fā)出紅色（Cy3）核染區(qū)和綠色（FITC）胞漿染色區(qū)。

1.7 細(xì)胞圖像分析

用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)腦梗死后不同時(shí)間段陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。每個(gè)動(dòng)物隨機(jī)選取相同位置的6張腦片，每張腦片在大鼠腦缺血半暗帶隨機(jī)選取6個(gè)視野（×400），計(jì)算每個(gè)視野的免疫陽(yáng)性細(xì)胞（BrdU、Nestin、BrdU/NF200）數(shù)目的平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠NSS的比較

表1顯示，大鼠造模后出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，其癥狀隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減輕；NSCs組移植后第2、4、7天 NSS與模型組比較差異均無(wú)顯著性（P＞0.05），但第 14、28天其 NSS均顯著低于模型組（P＜0.05）；而 NSCS移植 +清熱化瘀組則在第7、14、28天的 NSS顯著優(yōu)于模型組（P＜0.05）。

表1 大鼠 NSS的變化±s）

表1 大鼠 NSS的變化±s）

注：與 B組比較：*P＜0.05

NSS組別2d 4d 7d 14d 28d B組7.8±1.7 7.2±1.6 6.9±1.6 6.6±1.5 6.0±1.2 C組 7.5±1.5 7.0±1.4 6.4±1.2 5.5±1.1* 4.8±1.0*D組 7.3±1.4 6.7±1.3 5.8±1.1* 5.0±1.0* 4.0±0.8*

2.2 大鼠缺血腦損傷后NSCs增殖的比較

模型組大鼠腦缺血損傷后可以檢測(cè)到少量的nestin陽(yáng)性細(xì)胞，其表達(dá)于缺血后7d達(dá)高峰（P＜0.05），以后表達(dá)逐漸減弱；與模型組相比，NSCs組移植后 nestin表達(dá)在第 7、14、28天顯著增加；移植加中藥組在第14、28天時(shí)缺血半暗帶區(qū) nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較單純移植組顯著增加（P＜0.01，P＜0.05）。模型組大鼠腦缺血損傷后未能檢測(cè)到 BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，NSCs移植后可檢測(cè)到BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，主要分布在缺血周?chē)鷧^(qū)，并可見(jiàn)其從室旁區(qū)向缺血區(qū)移行，其表達(dá)于移植后14d達(dá)高峰（P＜0.05），以后表達(dá)逐漸減弱；移植加中藥組在第14、28天時(shí)缺血半暗帶區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較單純移植組顯著增加（P ＜0.05）（見(jiàn)表 2、3圖① ～ ④）。

表2 各組大鼠 nestin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較±s，n=5）

表2 各組大鼠 nestin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較±s，n=5）

注：與 B組比較：*P＜0.05，＊＊P＜0.01；與 C 組比較：△P ＜0.05；與組內(nèi)其他時(shí)間點(diǎn)比較：#P＜0.05

組別 時(shí)相2d 4d 7d 14d 28d A組00000 B組 4.22±1.46 8.89±1.63 13.78±2.15# 9.20±1.78 7.67±1.60 C組 5.03±1.34 10.65±1.93 20.32±2.45#＊＊15.24±2.21＊＊ 11.56±2.02*D組 6.12±1.27 12.29±1.98 22.25±2.73 18.79±2.67△ 15.25±2.36△

表3 各組大鼠 BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較±s，n=5）

表3 各組大鼠 BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較±s，n=5）

注：與 C組比較：△P＜0.05；與組內(nèi)其他時(shí)間點(diǎn)比較：*P＜0.05

組別 時(shí)相2d 4d 7d 14d 28d A組00000 B組 0 0 0 0 0 C組 16.23±2.65 25.74±3.21 33.26±4.76* 48.55±6.32* 30.58±5.24 D組 18.36±2.87 29.13±3.36 40.05±5.50 60.49±6.68△ 47.66±5.87△

2.3 新生神經(jīng)元比較

NSCs移植后 7d可見(jiàn)，少量的 BrdU/NF200雙陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)在缺血周?chē)帲浔磉_(dá)隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加；移植加中藥組在第14、28天時(shí)缺血半暗帶區(qū)BrdU/NF200雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較單純移植組顯著增加（P＜0.05）（見(jiàn)表4和圖⑤⑥）。

3 討論

NSCs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有自我更新能力和多種分化潛能的細(xì)胞，雖然終身存在，但由于其絕對(duì)數(shù)量和局部微環(huán)境所限，致使中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或變性時(shí)，自我修復(fù)作用微乎其微。因此，采用外源性干細(xì)胞移植成為近年來(lái)治療中樞神經(jīng)損傷的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，也同樣為腦缺血損傷的治療提供了新的思路。

表4 各組大鼠BrdU/NF200陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較± s，n=5）

表4 各組大鼠BrdU/NF200陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較± s，n=5）

注：與 C組比較：*P＜0.05

組別 時(shí)相2d 4d 7d 14d 28d B組0 0 0 0 0 C組 0 3.61±0.92 6.73±1.20 19.54±2.24 26.82±3.16 D組 0 5.24±1.08 9.24±1.33 31.60±3.57* 39.75±4.28*

①②:缺血7天C組和D組頂葉皮質(zhì)nestin蛋白表達(dá)(×400);③、④:缺血28天C組和D組頂葉皮質(zhì)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(×400);⑤⑥:缺血14天C組和D組頂葉皮質(zhì)BrdU/NF200雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(免疫熒光 ×400)

已有研究證實(shí)，NSCs移植能夠促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。如Park將NSCs注入缺血鼠腦中，NSCs可接合入變性的 CNS中，可優(yōu)先移入缺血區(qū)，并增殖分化為神經(jīng)元［3］。Shen等將 NSCs注入鼠腦缺血損傷區(qū)，可縮小缺血后腦梗死面積，改善神經(jīng)功能［4］。最近也有聯(lián)合移植的相關(guān)報(bào)道，如Yu等將NSCs和I型膠原聯(lián)合移植治療腦缺血，能夠顯著促進(jìn)損傷腦組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)［5］。中藥作為體內(nèi)微環(huán)境的調(diào)節(jié)劑，可能在減少神經(jīng)干細(xì)胞移植后的副反應(yīng)，促進(jìn)其分化和遷移等方面具有重要的作用，國(guó)內(nèi)在這方面也開(kāi)始了有益的嘗試［6］，顯示出較大潛力。但聯(lián)合應(yīng)用中藥復(fù)方和NSCs治療腦缺血的報(bào)道甚少，值得進(jìn)一步探討。

“毒損腦絡(luò)”學(xué)說(shuō)是中醫(yī)中風(fēng)認(rèn)識(shí)上的新理論，認(rèn)為中風(fēng)發(fā)病是由于毒邪損傷腦絡(luò)、絡(luò)脈破損或絡(luò)脈拘攣瘀閉、氣血滲灌失常所致［7］。結(jié)合腦缺血損傷后 NSCs的變化，我們認(rèn)為腦缺血急性期產(chǎn)生的痰瘀熱毒混雜腦內(nèi)，損傷腦髓及腦絡(luò)，NSCs的增殖分化遷移之源受到抑制、破壞，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損及功能恢復(fù)受限。因此我們認(rèn)為，解毒通絡(luò)是治療大法［8］，據(jù)此理論而設(shè)的清熱化瘀方，其功能為清熱解毒化痰、活血化瘀通絡(luò)，是治療腦梗死的有效方劑。一系列研究表明，其通過(guò)不同途徑對(duì)腦缺血損傷組織具有保護(hù)作用，作為腦神經(jīng)功能保護(hù)劑在臨床運(yùn)用方面有較好的療效［9～11］。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血損傷可以誘導(dǎo)少量nestin的表達(dá)，且在缺血后 7d時(shí)表達(dá)呈高峰；經(jīng)BrdU標(biāo)記的NSCs側(cè)腦室移植后2d即可見(jiàn)BrdU蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，主要分布在缺血周?chē)鷧^(qū)，并可見(jiàn)其從室旁區(qū)向缺血區(qū)移行，其表達(dá)于移植后14d達(dá)到高峰，說(shuō)明移植的 NSCs能夠在宿主腦內(nèi)存活；免疫熒光顯示，NSCs移植后 7d可見(jiàn) BrdU/NF200雙陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)在缺血周?chē)帲浔磉_(dá)隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，說(shuō)明移植的 NSCs能夠分化為新生神經(jīng)元，也提示移植NSCs對(duì)腦缺血大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)起到了積極作用；移植加中藥組可顯著增加缺血后第14、28天時(shí)缺血半暗帶區(qū) nestin、BrdU和 BrdU/NF200陽(yáng)性蛋白表達(dá)，說(shuō)明清熱化瘀方可促進(jìn) NSCs增殖為神經(jīng)元并促進(jìn)其遷移，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用，這為其早期給藥治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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