唐學(xué)敏，焦河玲，朱 艷

（南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)學(xué)院，河南 南陽 473000）

苦參堿（MT）是中藥苦參的主要有效成分，屬于四環(huán)的喹諾里西啶類（quinolizidine），分子式為C15H24N2。大量的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)，MT具有抗炎、抗病毒、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，并且其抗腫瘤的作用越來越得到重視。本文針對(duì)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW480增殖及細(xì)胞凋亡方面的影響，探討其對(duì)結(jié)直腸癌可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

苦參堿（寧夏鹽池制藥廠，批號(hào)071101），注射用環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)09031521），小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），Hoechst-33258染色試劑盒，Annexin VFITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），TRIzol（Invitrogen 公司）、SYBR PrimeScript Real TimeRT-PCR kit（大連 TaKaRa生物工程公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。450型酶標(biāo)儀、日本RICOH公司，倒置相差顯微鏡、日本 OLYMUPS公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國 Becton Dickinson公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株SW480由中山大學(xué)細(xì)胞中心提供，使用含有體積分?jǐn)?shù)為10％的胎牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)液，在37℃和5％CO2實(shí)驗(yàn)條件下常規(guī)培養(yǎng)，于指數(shù)生長(zhǎng)期用不同濃度的藥物處理相應(yīng)時(shí)間后進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 MTT法檢測(cè) MT對(duì)SW480細(xì)胞增殖影響

取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞加入96孔板中，每孔6000個(gè)細(xì)胞 180μl。細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的 MT 20μl，使其終濃度分別為 0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80和1.6 0mg/ml，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和調(diào)零孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h，用 MTT法測(cè)490nm波長(zhǎng)處吸光度（OD）值，并按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：生長(zhǎng)抑制率（％）=（1－用藥組 OD值/對(duì)照組 OD值）×100％。按Bliss法求出半數(shù)抑制濃度（IC50值）。

1.4 光鏡觀察

將SW480細(xì)胞培養(yǎng)于玻片上，加入終濃度為0.35，0.70mg/mlMT以及不含藥物的等體積 RPM I-1640培養(yǎng)液（對(duì)照組），分別培養(yǎng)24h和48h后光鏡觀察并拍照。

1.5 染色觀察

以PBS洗上述各組細(xì)胞2次，70％乙醇4C固定 5min，PBS沖洗，Hoechst-33258染色 10min熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6 流式細(xì)胞儀測(cè)定SW480細(xì)胞凋亡率

以 0.7mg·mL－1藥物作用細(xì)胞 24h、48h 后，以0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液后調(diào)制細(xì)胞濃度至2×106·mL－1細(xì)胞，分別進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.7 熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè) Caspase 3、Bcl-2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平

表 1顯示，以 0.7mg·mL－1藥物作用細(xì)胞 24h、48h后，Trizol法提取各組的 Total RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit，Takara）的操作說明書，將 mRNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。按照 QPCR試劑盒（SYBR Premix EX TaqTM，Takara）的操作說明書，QPCR檢測(cè) Caspase 3及 Bcl-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。看家基因β-actin作為內(nèi)參，用相對(duì)定量方法（ΔΔCT）來計(jì)算分析各組 Caspase 3、Bcl-2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。

Table 1 Primer set used for real-time PCR

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 珋x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD法，方差不齊的采用Tamhanes T2法。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定MT對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響

圖1顯示，MTT法檢測(cè)不同濃度的苦參堿作用于人結(jié)腸腺癌SW480細(xì)胞不同時(shí)間，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用如圖1。結(jié)果表明，MT能顯著抑制 SW480細(xì)胞的增殖，并有明顯的劑量效應(yīng)及時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

2.2 光鏡觀察結(jié)果

圖2顯示，經(jīng)0.35mg/mlMT作用48h后 SW480細(xì)胞細(xì)胞逐漸變?yōu)閳A形，體積縮小，培養(yǎng)液中出現(xiàn)少量漂浮細(xì)胞，0.70mg/ml作用后上述改變更為明顯，正常對(duì)照組細(xì)胞則未見明顯改變。

2.3 MT對(duì) SW480細(xì)胞凋亡的影響

圖3顯示，經(jīng) 0.35，0.7mg/mlMT作用 48 h后凋亡細(xì)胞Hoechst-33258熒光染色較未凋亡細(xì)胞增強(qiáng)并出現(xiàn)核固縮。圖4顯示，經(jīng)0.7 mg/mlMT作用后，24h組及48 h組第4象限即早期凋亡細(xì)胞數(shù)增多，凋亡率分別達(dá)22.08％和34.48％，并出現(xiàn)了晚期凋亡現(xiàn)象，空白對(duì)照組第1象限細(xì)胞數(shù)量則較多，細(xì)胞凋亡率低于6.0％。

2.4 MT對(duì) SW480細(xì)胞 Caspase 3、Caspase 9及 Bcl-2表達(dá)的影響

圖5A顯示，SW480細(xì)胞經(jīng)0.7mg/ml MT作用后，其 24h組及 48 h組 Caspase 3、Caspase 9 mRNA表達(dá)升高。圖5B顯示，Bcl-2表達(dá)則降低相對(duì)于對(duì)照組降低達(dá)41.08％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

圖2 光鏡下各組SW480細(xì)胞A.Control group；B.MT group 24h；C.MT group 48h

圖3 Hoechst-33258染色下各組SW480細(xì)胞A.MT group 48h；B.MT group 24h；C.Control group

圖4 各組SW480細(xì)胞AnnexinⅤ-FITC檢測(cè)結(jié)果A：Control group；B：MT group 24h；C：MT group 48h

4 討論

大腸癌是全球發(fā)病率居第三位的常見腫瘤，其發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)。目前，針對(duì)大腸癌的化療方案主要是以5-Fu為主的綜合化療，其毒副反應(yīng)大。中藥以其獨(dú)特的抗腫瘤療效、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，已引起世界各國科研工作者的關(guān)注。體外實(shí)驗(yàn)表明，苦參堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制或殺傷作用，對(duì)HepG2、K562、HL260有明顯的抑制作用，并能誘導(dǎo)分化和凋亡［1］。Hua Jiang 等［2］人的研究表明，苦參堿可誘發(fā)細(xì)胞色素 C釋放，激活 caspase-3和caspase-9，從而通過線粒體途徑誘導(dǎo) K562細(xì)胞凋亡。體內(nèi)試驗(yàn)也表明［3］，苦參堿不僅抑制人胃癌細(xì)胞株裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，還能增強(qiáng)5-FU的抑瘤能力?？鄥A對(duì)SW620結(jié)腸腺癌細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，是很有潛力的抗癌藥物［4］。

圖5A Caspase 3mRNA熒光定量PCR相對(duì)定量，與對(duì)照組相比 P＜0.05

圖5B Bcl-2 mRNA熒光定量PCR相對(duì)定量，與對(duì)照組相比 P＜0.05圖5 MT作用SW480后Caspase 3、Bcl-2 mRNA熒光定量PCR相對(duì)定量

本實(shí)驗(yàn)以MTT法測(cè)定MT對(duì)人結(jié)腸腺癌SW480細(xì)胞株的增殖抑制作用，確認(rèn)其48 h增殖抑制活性IC50為0.7 mg/ml。眾所周知，腫瘤細(xì)胞在增殖過程中受到多種因素影響，而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及其治療中起重要作用。人們?cè)跈z測(cè)細(xì)胞凋亡的多種方法中，主要是根據(jù)凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征、生化代謝及生物水平上發(fā)生的改變來進(jìn)行分析。一般認(rèn)為，形態(tài)學(xué)變化是判斷凋亡的基礎(chǔ)［5］。我們采用光學(xué)顯微鏡觀察 MT對(duì) SW480的影響，可見細(xì)胞核固縮、核碎裂、細(xì)胞膜起泡等形態(tài)。Hoechst-33258染色及流式細(xì)胞儀分析結(jié)果證明，MT可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡，其凋亡現(xiàn)象顯示時(shí)間依賴性增加。

國內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)許多凋亡基因的相關(guān)性，其中以 Caspase-3家族和 Bcl-2家族最為關(guān)注［6、7］。Caspase為半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase）的簡(jiǎn)稱，是一組具有相似氨基酸序列的半胱氨酸蛋白酶，它除了參與細(xì)胞因子成熟，細(xì)胞生長(zhǎng)和分化之外，還與細(xì)胞凋亡緊密聯(lián)系［8］。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)在凋亡通路中處于重要地位，尤其是Caspase-3是其中的中心環(huán)節(jié)，也是細(xì)胞凋亡的主要參與成分［9～11］。Bcl-2是一種新型的原癌基因，Bcl-2蛋白對(duì)不同因素引起的細(xì)胞凋亡均有抑制作用，在各種正常細(xì)胞的發(fā)育過程中表達(dá)，而在成熟或走向凋亡的細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)0.7 mg/m MT作用 24、48h后 SW480細(xì)胞的Caspase-3 mRNA水平增高，Bcl-2 mRNA水平下降，說明 MT可通過影響凋亡基因 Bcl-2和 Caspase-3的表達(dá)使 SW480細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤作用。這可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。

大量實(shí)驗(yàn)研究證明，包括很多中藥提取物在內(nèi)的多種抗癌藥物的抗癌作用涉及到多種基因及通路的相互影響，最終通過受表達(dá)的蛋白來實(shí)現(xiàn)［13］。我們將在今后更深入地探討MT誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，并進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)療效，為開發(fā)和利用苦豆子資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］王鐵軍，李紹平，簡(jiǎn)家榮，等.苦參堿抗腫瘤作用研究進(jìn)展［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2004，10（4）：52-5.

［2］Hua J，Chun HH，Shu BZ，et al. Matrine upregulates the cell cycle protein E2F-1 and triggers apoptosis via the mitochondrial pathway in K562 cells［J］. Eur J Pharmacol，2007，559：98-108.

［3］胡梅潔，曾 暉，章永平，等.苦參堿聯(lián)合5-FU抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)作用及機(jī)制［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)報(bào)，2006，23（2）：164-7.

［4］王曉燕，梁 磊，鄧虹珠，等.苦參堿體外誘導(dǎo)人結(jié)腸腺癌SW620細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) ，2008，28（3）：432-5.

［5］王嘉寧，郭 寧.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)技術(shù)與方法［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2005，19（6）：466-70.

［6］Giamarellos-Bourboulis EJ，Koussoulas V，Panagou C，et al.Experimentalsep sis using Pseudomonas aeruginosa：the significance of multi2drug resistance［J］. Int J Antimicrob Agents，2004，24（4）：357-61.

［7］Lo MY，Kim HT.Chondrocyte apoptosis induced by hydrogen peroxiderequires caspase activation but not mitochondrial pore transition［J］. JOrthop Res，2004，22（5）：1120-5.

［8］李雪松，荊國杰.亞低溫對(duì)大鼠腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響［J］.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2005，4（1）：31-33.

［9］Ohba H，Moriwaki S，Bakalova R，et al.Plant-derived abrin-ain duces apoptosis in cultured leukemic cell lines by different mechanismis［J］. Toxicol App l Pharmacol，2004，195（2）：182-93.

［10］Way TD，Kao MC，Lina JK. Degradation of HER2/neu by apigenin induces apoptosis through cytochromecrelease and caspase-3 activation in HER2 /neu-over exp ressssing breast cancer cells［J］. FEBS Lett，2005，579（1）：145-52.

［11］Woo DH，Han IS，Jung G.Mefenamic acid-induced apoptosis in human liver cancer cell-lines through Caspase pathway［J］. Life Sci，2004，75（20）：2439-49.

［12］Petit A，Mwale F，Zukor D J，et al. Effect of cobalt and chromium ions on bcl-2， bax， caspase-3， and caspase-8 expression in human U937 macraophages［J］. Biomarials，2004，25（11）：2013-8.

［13］Deng R，Zhu X F，Zhou JM，et al. Apoptosis induced by Excisanin A in human colon cancerSW620 cellsand its mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22（3）：273-7.