潘洪彬 王 靜 黃 英 趙素梅 張 曦 葛長(zhǎng)榮 高士爭(zhēng)

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650201)

烏金豬是云南優(yōu)良地方豬種之一,具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)優(yōu)良、肌內(nèi)脂肪豐富等優(yōu)良性狀[1]。研究不同能量水平的飼糧對(duì)烏金豬脂肪組織中脂類(lèi)分解代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響,對(duì)闡明飼糧能量水平對(duì)豬脂肪組織脂類(lèi)代謝影響的分子機(jī)制具有重要科學(xué)意義。

激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase,HSL)是調(diào)節(jié)脂肪動(dòng)員的關(guān)鍵酶,是脂肪分解的限速酶,HSL能水解甘油三酯成甘油和脂肪酸以滿足動(dòng)物體的需要[2]。線粒體膜上的肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(carnitine acyl transferase,CPT)能催化脂?；谌鈮A和輔酶A之間的轉(zhuǎn)移反應(yīng),CPT-Ⅰ是脂酰輔酶A轉(zhuǎn)入線粒體中脂肪酸 β-氧化的限速酶[3]；脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵酶,可水解極低密度脂蛋白和乳糜微粒中的甘油三酯,使之轉(zhuǎn)變成相對(duì)分子質(zhì)量較小的脂肪酸,以供各種組織貯存和利用[4]；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 γ(preoxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)是一類(lèi)由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,屬于細(xì)胞核受體超家族的成員[5],PPARγ不僅參與脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控,調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝,同時(shí)在控制脂肪儲(chǔ)存和釋放、維持機(jī)體能量平衡和調(diào)節(jié)胰島素抵抗及血糖的穩(wěn)定等方面有正向調(diào)節(jié)作用[6]。

在前期研究中,本實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)研究了飼糧不同能量水平對(duì)烏金豬生長(zhǎng)、胴體組成和肉品質(zhì)的影響,得出了烏金豬在不同生長(zhǎng)階段獲得最佳肉品質(zhì)所需的飼糧能量水平[7-8],并研究了飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)豬脂肪組織中脂類(lèi)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響和飼糧能量水平對(duì)豬脂肪組織中脂類(lèi)合成代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響[9-10]。本文在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步深入研究飼糧不同能量水平對(duì)烏金豬脂肪組織脂類(lèi)分解代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響,從基因水平闡明飼糧營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)豬脂肪組織脂類(lèi)分解代謝影響的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取健康、胎次相近、體重約15 kg的烏金豬54頭,公母各占1/2,單因子隨機(jī)分為3組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)6頭豬,分別飼喂3個(gè)消化能水平的飼糧。試驗(yàn)分15～30 kg、31～60 kg和61～100 kg體重3個(gè)階段,各階段換料逐漸過(guò)渡,過(guò)渡期為7 d,日飼喂3次,自由飲水,分別于30、60和100 kg體重時(shí)分批屠宰,每批屠宰6頭,取背部外層皮下脂肪組織于-80℃保存待測(cè)。

1.2 試驗(yàn)飼糧

根據(jù)《動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)參數(shù)與飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn):中國(guó)肉脂型生長(zhǎng)肥育豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》[11]設(shè)計(jì)烏金豬飼糧,各階段飼糧蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)水平基本一致,中能組飼糧以飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的消化能為標(biāo)準(zhǔn),高、低能組飼糧消化能上下調(diào)整10%,分別為:低能組11.74 MJ/kg,中能組12.89 MJ/kg,高能組14.22 MJ/kg[7-8]。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis)

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)

1.3.1 總RNA提取

取每批屠宰的6頭烏金豬的背部外層皮下脂肪組織樣品,用Trizol試劑提取總RNA,用紫外分光光度計(jì)(260 nm)和變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定總RNA濃度與純度。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄

取 2 μ g 總 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 ,反應(yīng)采用 20 μ L體系 :12 μmol/L 隨機(jī)引物 、0.5 mmol/L dNTP、20 U/μ L RNA 酶 抑 制 劑 (RNase inhibitor)、10 U/μ L反轉(zhuǎn)錄酶 (M-MLV RTase)、4 μ L 5 ×RT Buffer[含 250mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、50 mmol/L MgCl2、250 mmol/L KCl、50 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)、2.5 mmol/L亞精胺(Spermidine)]。先加RNA模板,dNTP和隨機(jī)引物,70℃變性5 min,立即冷卻,再加其余試劑37℃反應(yīng)60 min,95℃滅活5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR及其條件優(yōu)化

目的基因 (HSL 、CPT-Ⅰ 、LPL、PPARγ)和內(nèi)參基因 β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物使用 Primer 5.0軟件根據(jù)GenBank中豬的基因序列設(shè)計(jì),引物序列及參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR特異性引物序列及參數(shù)Table 2 Sequences and parameters of specific primers for real-time PCR

實(shí)時(shí)定量 PCR 采用20 μ L反應(yīng)體系:1.5 μ L反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 、10 μ L iQTMSYBR Green Supermix(BIO-RAD, 美 國(guó) )、 0.25mmol/μ L dNTP、0.5 mmol/L目的基因引物。同時(shí)用雙蒸水代替RT產(chǎn)物和熒光試劑作空白對(duì)照。每樣品做2次重復(fù),取其平均值代入2-ΔΔCT公式進(jìn)行計(jì)算。各基因PCR的優(yōu)化條件見(jiàn)表3。

表3 實(shí)時(shí)定量PCR條件Table 3 Conditions for real-time PCR

1.4 定量方法

每個(gè)樣本的目標(biāo)基因表達(dá)量為通過(guò)內(nèi)參基因均一化處理后相對(duì)于低能組(設(shè)為1倍量)的倍數(shù)。

各基因基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式[12]如下:

式中,CT為閾值循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)平均值進(jìn)行方差分析,作顯著性檢驗(yàn)(P＜0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 HSL基因的表達(dá)水平

由表4可知,在30和100 kg體重時(shí),脂肪組織中HSL基因的表達(dá)水平隨飼糧能量的升高而逐漸降低,且與低能組相比,高能組30 kg體重時(shí)、中能組30和100 kg時(shí)表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05)；在60 kg體重時(shí),HSL基因的表達(dá)水平隨飼糧能量的升高而升高(P＜0.05)；隨著豬體重的增加,脂肪組織中HSL基因的表達(dá)水平下降。

表4 飼糧能量水平對(duì)不同生長(zhǎng)階段豬脂肪組織中激素敏感脂肪酶基因的表達(dá)水平的影響Table 4 Effects of dietary energy level on expression level of HSL in adipose tissue of pigs at different growth stages

2.2 LPL基因的表達(dá)水平

由表5可知,在烏金豬不同生長(zhǎng)階段,LPL基因的表達(dá)水平隨飼糧能量升高而升高,30 kg體重時(shí),高能組顯著高于低、中能組(P＜0.05),60和100 kg體重時(shí),中、高能組顯著高于低能組(P＜0.05)；在60 kg體重時(shí),各組LPL基因的表達(dá)水平均分別高于其他2個(gè)體重階段。

表5 飼糧能量水平對(duì)不同生長(zhǎng)階段豬脂肪組織中脂蛋白脂酶基因的表達(dá)水平的影響Table 5 Effects of dietary energy level on expression level of LPL in adipose tissue of pigs at different growth stages

2.3 CPT-Ⅰ基因的表達(dá)水平

由表6可知,在60 kg體重時(shí),CPT-Ⅰ基因的表達(dá)水平隨飼糧能量水平的升高而升高,中、高能組上調(diào)CPT-Ⅰ基因的表達(dá)(P ＜0.05)；在30和100 kg體重時(shí),CPT-Ⅰ基因的表達(dá)水平隨飼糧能量水平的升高而降低,且30 kg體重時(shí)高能組以及100 kg體重時(shí)中、高能組的表達(dá)水平均為顯著降低 (P ＜0.05)。

表6 飼糧能量水平對(duì)不同生長(zhǎng)階段豬脂肪組織中肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ基因的表達(dá)水平的影響Table 6 Effects of dietary energy level on expression level of CPT-Ⅰin adipose tissue of pigs at different growth stages

2.4 PPAR γ基因的表達(dá)水平

由表7可知,在60 kg體重時(shí),PPARγ基因的表達(dá)水平隨飼糧能量水平的升高而升高,中、高能組PPARγ基因的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)；在30和100 kg體重時(shí),PPARγ基因的表達(dá)水平隨飼糧能量水平的升高而降低,且30 kg體重時(shí)高能組以及100 kg體重時(shí)中、高能組的表達(dá)水平均為顯著降低(P ＜0.05)。

表7 飼糧能量水平對(duì)不同生長(zhǎng)階段豬脂肪組織中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 γ基因的表達(dá)水平的影響Table 7 Effects of dietary energy level on expression level of PPARγin adipose tissue of pigs at different growth stages

3 討 論

動(dòng)物體脂沉積是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程,品種、生長(zhǎng)階段及營(yíng)養(yǎng)水平都可影響動(dòng)物機(jī)體脂肪的沉積,其中飼糧能量水平是影響動(dòng)物機(jī)體脂肪沉積的重要因素之一。作者的前期研究結(jié)果表明,不同生長(zhǎng)階段烏金豬的脂肪沉積率隨飼糧能量水平的升高而升高[10]。

動(dòng)物體脂沉積的多少取決于脂肪酸的合成、分解及轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程,脂肪組織中脂肪的分解及脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化對(duì)脂肪沉積有著重要影響。HSL是脂肪分解的關(guān)鍵酶,將甘油三酯分解成甘油和脂肪酸以滿足動(dòng)物體的需要[2]。HSL主要在脂肪組織中表達(dá)[13],受胰島素、胰高血糖素等多種激素的調(diào)節(jié)[14],而且受生長(zhǎng)階段和飼糧營(yíng)養(yǎng)水平的影響,低能量或含多不飽和脂肪酸較高的飼糧可增加HSL的活性[15]。CPT-Ⅰ位于線粒體外膜,負(fù)責(zé)將長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體[3]。當(dāng)脂肪動(dòng)員作用加強(qiáng)時(shí),較多的脂肪酸為機(jī)體提供能量,此時(shí)CPT-Ⅰ活性增加,脂肪酸的 β-氧化增強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,高能量飼糧顯著上調(diào)60 kg體重烏金豬脂肪組織中HSL和CPT-Ⅰ基因的表達(dá)水平,說(shuō)明可能脂肪組織中脂肪的分解代謝加強(qiáng),產(chǎn)生的脂肪酸增加,進(jìn)入線粒體進(jìn)行 β-氧化的脂肪酸增多,脂肪酸的氧化作用增強(qiáng),這一階段脂肪的沉積能力較弱。高能量飼糧顯著下調(diào)30和100 kg體重烏金豬脂肪組織中HSL和CPT-Ⅰ基因的表達(dá)水平,并且100 kg體重時(shí),飼喂高能量日糧烏金豬的脂肪率比飼喂低能量飼糧烏金豬的脂肪率高19.25%(P＜0.01)[10],可能由于脂肪組織中脂肪的分解和脂肪酸的氧化作用減弱,促進(jìn)烏金豬生長(zhǎng)的早期和后期脂肪的沉積。

LPL主要由脂肪組織合成并分泌到血液中,將血液中乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯水解為脂肪酸[4],肥型豬脂肪組織中LPL的水平顯著高于瘦肉型豬[5]。目前普遍認(rèn)為,LPL與機(jī)體的脂類(lèi)代謝及肥胖密切相關(guān),白色脂肪組織中LPL的活性升高有助于機(jī)體脂類(lèi)的貯存[16]。研究表明,用含20%飽和脂肪酸或富含亞油酸的非飽和脂肪酸的高脂肪飼糧和含2%紅花油的低脂肪飼糧飼喂大鼠3周,高脂肪飼糧可降低腎周組織LPL基因的表達(dá),上調(diào)腎周棕色脂肪組織LPL基因的表達(dá),對(duì)腎周白色脂肪組織LPL基因的表達(dá)無(wú)顯著影響[17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,高能量飼糧上調(diào)不同生長(zhǎng)階段烏金豬脂肪組織LPL基因的表達(dá),且60 kg體重時(shí)的表達(dá)水平高于30和100 kg體重,表明高能量水平飼糧可促進(jìn)機(jī)體脂肪酸的利用。

PPARγ是一類(lèi)由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,具有調(diào)節(jié)LPL和HSL基因的表達(dá)的活性[18]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,高能量飼糧可顯著上調(diào)60 kg體重時(shí)烏金豬脂肪組織PPARγ基因的表達(dá),抑制30和100 kg體重時(shí)PPARγ基因的表達(dá),其表達(dá)水平的變化與LPL及HSL基因的表達(dá)一致,表明PPARγ基因的表達(dá)與LPL及HSL基因的表達(dá)具有協(xié)同作用,PPARγ基因通過(guò)調(diào)節(jié)LPL及HSL基因的表達(dá)參與脂肪組織的脂類(lèi)代謝。

4 結(jié) 論

①高能量飼糧可下調(diào)烏金豬在30和100 kg時(shí)脂肪組織HSL、CPT-Ⅰ和PPARγ基因的表達(dá),上調(diào)LPL基因的表達(dá),可能降低烏金豬生長(zhǎng)的早期和后期階段脂肪組織中脂肪的分解和脂肪酸的β-氧化。

②高能量飼糧可上調(diào)烏金豬在60 kg體重時(shí)脂肪組織 HSL、CPT-Ⅰ 、PPARγ和 LPL基因的表達(dá),可能增強(qiáng)這一生長(zhǎng)階段烏金豬脂肪組織中脂肪的分解和脂肪酸的 β-氧化。

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