伍 曦 羅 輝 馮 琳,2,3 劉 揚,2,3 姜 俊,2,3 周小秋,2,3*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所,雅安 625014；2.魚類營養(yǎng)與安全生產(chǎn)四川省重點高校實驗室,雅安 625014；3.動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室,雅安 625014)

維生素E是魚類所必需的營養(yǎng)物質(zhì),缺乏維生素E會導致魚類出現(xiàn)生長緩慢、死亡率增加、血液紅細胞受損等缺乏癥[1-3]。已有的研究發(fā)現(xiàn)維生素E能促進普通鯉魚(Cyprinus carpio L.)[2]、條石鯛(Oplegnathus fasciatus)[3]的生長,且有研究表明高于NRC推薦量的維生素E水平能顯著提高 斑 點叉 尾 鮰 (Ictaluruspunctatus Rafinesque)[4]、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[5]的生長性能。魚類生長與其消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力有關(guān)[6],而消化器官的生長發(fā)育狀況影響魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[7]。此外,魚類腸道胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶等消化酶及堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶等刷狀緣酶涉及對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[8-9],但目前僅見1篇關(guān)于維生素E能夠增加斑點叉尾鮰胃腸道蛋白酶以及脂肪酶活力的報道[4],而高水平維生素E對鯉魚等無胃魚類消化酶活力的影響以及對魚類消化器官生長發(fā)育和腸道刷狀緣酶活力的影響尚未見報道,因此開展相關(guān)研究很有必要。本試驗擬研究高水平維生素E對幼建鯉(Cyprinus carpio var.Jian)生長性能的影響,并通過考察消化器官生長發(fā)育及消化吸收酶活力來研究高水平維生素E對幼建鯉消化吸收功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與試驗飼料

選用平均體重為(9.46±0.03)g的同一批次健康幼建鯉1 200尾,隨機分為8組,每組3個重復,每重復50尾魚,分別飼喂維生素E(DL-α-生育酚醋酸酯,純度為50%)添加水平為0(未添加對照 組)、100(NRC 推薦 量組)、750、1 000、1 250、1 500、1 750和 2 000 mg/kg的試驗飼料,試驗期60 d。試驗飼料以魚粉、大米蛋白粉為蛋白質(zhì)源,其組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料加工參考Lim等[5]的方法,并略作調(diào)整,原料經(jīng)粉碎后過60目篩,混勻后加水經(jīng)制料機制成條狀飼料,自然風干后經(jīng)碎料機制成粒徑為1.5 mm左右的顆粒料,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.2 飼養(yǎng)管理

魚苗購回馴化30 d后開始正式試驗,將魚苗飼養(yǎng)于循環(huán)流水過濾水族箱(90 cm×55 cm×30 cm)中,曝氣自來水為水源。試驗期平均水溫為(21.0±1.0)℃,pH 7.0左右,溶氧保持在5 mg/L以上。試驗期間根據(jù)幼建鯉攝食量、生長速度和水溫條件而調(diào)整投喂量,保證每次飼喂30 min后有剩料,迅速收集剩料用以計算攝食量。

1.3 指標測定

1.3.1 生長性能

試驗開始和結(jié)束時對試驗魚稱重,計算增重。試驗期間記錄每天的攝食量,收集剩料并烘干稱重,試驗結(jié)束后計算攝食量和飼料系數(shù)。試驗前隨機選取與試驗魚體重一致的16尾魚用于魚體蛋白質(zhì)、脂肪和灰分含量測定。試驗結(jié)束時,每重復隨機選取5尾魚,經(jīng)冷凍干燥后分別用凱氏定氮法、索氏抽提法和高溫灼燒法測定魚體蛋白質(zhì)、脂肪和灰分含量,并計算蛋白質(zhì)、脂肪和灰分的沉積率。計算公式為:

式中,B為試驗結(jié)束時魚體中蛋白質(zhì)(脂肪或灰分)總量(g)；A為試驗開始時魚體中蛋白質(zhì)(脂肪或灰分)總量(g)；I為試驗期蛋白質(zhì)(脂肪或灰分)攝入總量(g)。

1.3.2 肝胰臟和腸道重量及蛋白質(zhì)含量

試驗最后1次投喂后12 h,每組選取體重接近的25尾魚,分離出肝胰臟與腸道,迅速稱重后經(jīng)液氮速凍,-70℃保存?zhèn)溆?。每組隨機選5尾魚的肝胰臟和腸道,用考馬斯亮藍法測定其蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 腸道皺襞高度

試驗最后1次投喂后12 h,從組1、2、5選取體重接近的4尾魚,分離前、中和后腸,分別固定于10%福爾馬林溶液中,按常規(guī)組織切片程序進行脫水 、石蠟 +包埋 、切片 (厚度 5 ～6 μm)和蘇木精-伊紅(HE)染色。用目視測微尺測定每段腸樣5個完整皺襞的高度,取其平均值作為該樣品皺襞高度的測定結(jié)果。

1.3.4 腸道消化酶和刷狀緣酶活力

每組從-70℃保存的樣品中隨機選5尾魚的腸道,于冰上解凍后迅速稱重,其后加入4℃生理鹽水,并在冰浴中用剪刀剪碎,再經(jīng)超聲波細胞破碎儀制成組織勻漿,用于測定消化酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)活力；每組隨機另選5尾魚的腸道用相同方法制備組織勻漿以測定刷狀緣酶(堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶)活力。胰蛋白酶和糜蛋白酶活力的測定分別采用N-苯甲酸精氨酸-對硝基苯胺 (BNPNA)法[11]和 Hummel法[12],脂肪酶活力的測定采用滴定法[11],堿性磷酸酶活力根據(jù)堿性磷酸酶在堿性溶液中的顏色反應測定,Na+,K+-ATP酶活力采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果采用平均值 ±標準差表示,用統(tǒng)計軟件SPSS 11.0對數(shù)據(jù)進行方差分析,結(jié)合Duncan氏法進行多重比較,檢驗各組之間差異顯著性,P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 生長性能

維生素E對幼建鯉生長性能的影響見表2。末重、增重、攝食量、蛋白質(zhì)沉積率、脂肪沉積率和灰分沉積率先隨維生素E含量增加而顯著增加(P＜0.05),在組 5(飼料中維生素 E含量1 257 mg/kg)達到最大值,其后隨維生素E含量繼續(xù)增加有所下降。飼料系數(shù)與增重有相反的變化趨勢。以增重為標識,根據(jù)二次曲線法確定幼建鯉飼料中維生素E最適水平為1 106 mg/kg(Y=-2.170 6×10-6X2+0.004 8X+7.378 4,R2=0.911,P ＜0.01)。

2.2 消化器官生長發(fā)育

維生素E對幼建鯉消化器官生長發(fā)育的影響見表3。肝胰臟和腸道重量隨維生素E含量增加而顯著增加(P＜0.05),在組5達到最大值,其后隨維生素E含量繼續(xù)增加有所下降；肝胰臟和腸道蛋白質(zhì)含量也有近似的變化趨勢,且均在組5達到最大值。

2.3 腸道皺襞高度

維生素E對幼建鯉腸道皺襞高度的影響見表4。組5前、中和后腸皺襞高度顯著高于組1(飼料維生素E含量7 mg/kg)(P＜0.05),且前和后腸皺襞高度顯著高于組2(飼料維生素 E含量107 mg/kg)(P＜0.05)；組2前和后腸皺襞高度顯著高于組1(P ＜0.05)。

表2 維生素E對幼建鯉生長性能的影響Table 2 Effects of dietary vitamin E on growth performance of juvenile Jian carp

表3 維生素E對幼建鯉肝胰臟重量、肝胰臟蛋白質(zhì)含量、腸道重量和腸道蛋白質(zhì)含量的影響Table 3 Effects of dietary vitamin E on hepatopancreas weight,heptopancreas protein content,intestine weight and intestine protein content of juvenile Jian carp

表4 維生素E對幼建鯉前、中和后腸皺襞高度的影響Table 4 Effects of dietary vitamin E on folds height in foregut,midgut and hindgut of juvenile Jian carp μm

2.4 腸道消化酶和刷狀緣酶活力

由表5可見,維生素E對幼建鯉腸道消化酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶)活力有顯著影響(P＜0.05)。腸道胰蛋白酶活力隨維生素E含量增加而顯著增加(P＜0.05),在組5達到最大值,其后隨維生素E含量繼續(xù)增加有所下降；腸道糜蛋白酶和脂肪酶活力也有近似的變化趨勢,且均在組5達到最大值。

表5 維生素E對幼建鯉腸道消化酶活力的影響Table 5 Effects of dietary vitamin E on the digestive enzyme activities in intestinal tract of juvenile Jian carp U/g

由表6可見,維生素E對幼建鯉腸道刷狀緣酶(堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶)活力有顯著影響(P＜0.05)。堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶活力均隨維生素E含量增加而顯著增加(P＜0.05),在組5達到最大值,其后隨維生素E含量繼續(xù)增加有所下降。

表6 維生素E對幼建鯉腸道刷狀緣酶活力的影響Table 6 Effects of dietary vitamin E on the brush border enzyme activities in intestinal tract of juvenile Jian carp U/g

3 討 論

3.1 高水平維生素E對幼建鯉生長性能的影響

維生素E是水生動物必需的營養(yǎng)素,飼料中適宜水平的維生素E可提高條石鯛[3]、斑點叉尾鮰[4]等的生長性能。本研究發(fā)現(xiàn),當維生素E含量達到1 257 mg/kg時幼建鯉增重最大,且比NRC推薦量組(飼料維生素E含量107 mg/kg)提高32.62%。這說明適宜高水平維生素E能促進魚類的生長。然而,本試驗的增重整體偏低,其原因可能與水溫有關(guān)。本試驗平均水溫在21℃左右,建鯉適宜生長水溫在26℃左右,水溫過低會降低魚的增重。本實驗室研究幼建鯉對泛酸[13]、硫胺素[14]的需求時水溫高于本試驗3～4℃,相應地其相近初始體重的幼建鯉在飼養(yǎng)相近時間后增重高于本試驗。攝食量及飼料系數(shù)會影響魚類生長。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),維生素 E含量為1 257 mg/kg組與NRC推薦量組相比,攝食量提高13.75%。在斑點叉尾鮰上的研究也發(fā)現(xiàn)維生素E對攝食量有提高的作用[4]。此外,當飼料維生素E含量達到1 257 mg/kg時,飼料系數(shù)最小。而前人的研究也表明,維生素E能夠顯著降低南亞野鯪(Labeo rohita)的飼料系數(shù)[15],提高印度鯪(Cirrhinus mrigala)的飼料效率[16]。進一步分析表明,增重與攝食量和飼料系數(shù)之間均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系 (r=0.995 0,P ＜0.01；r=0.993 0,P ＜0.01),說明高水平維生素E可通過提高攝食量和降低飼料系數(shù)來促進幼建鯉生長。魚類的增重主要是由體蛋白質(zhì)、體脂肪和體灰分沉積引起[17]。本研究表明,飼料維生素E含量達到1 257 mg/kg時,與NRC推薦量組相比,魚體蛋白質(zhì)、脂肪和灰分沉積率分別提高39.68%、15.30%和46.35%,說明適宜高水平維生素E能增加機體蛋白質(zhì)、脂肪和灰分的沉積。

普通鯉魚缺乏維生素E會引起生長受阻、骨骼肌變性壞死等缺乏癥[2,18]。目前,普通鯉魚等魚類確定的維生素E需要量大多指不出現(xiàn)缺乏癥的最低需要量[1-2],也有少量采用最佳生長時的用量[3],但其設(shè)計水平是以最低需要量為基礎(chǔ)適當放寬的結(jié)果。有研究表明,高于最低需要量數(shù)倍的維生素E對魚類具有促進生長及提高免疫的作用[5],因此以不出現(xiàn)缺乏癥為標準確定的需要量并不能滿足最佳生長的需要。因此,本研究以幼建鯉最佳生長為判斷依據(jù)確定了維生素E的適宜水平為1 106 mg/kg,高于最低需要量10倍左右。該結(jié)果與Lim等[5]在尼羅羅非魚上的研究結(jié)果一致。然而,當維生素 E含量超過1 257 mg/kg以后,幼建鯉攝食量、增重開始下降,說明過高水平維生素E對魚類生長不利。這與Takeuchi等[19]在草魚上的發(fā)現(xiàn)一致。維生素E過量引起生長性能下降的原因可能與維生素E過量造成其他脂溶性維生素(如維生素 D和維生素K)的缺乏有關(guān)[20]。

3.2 高水平維生素E對幼建鯉消化器官生長發(fā)育的影響

魚類胰腺與腸道的生長發(fā)育狀況會影響消化吸收酶的分泌量與活力[6]。目前未見維生素E影響魚類消化器官生長發(fā)育的研究報道。本研究表明,維生素E含量為1 257 mg/kg組與NRC推薦量組相比,肝胰臟重量和蛋白質(zhì)含量分別提高24.95%和25.15%。這說明適宜高水平維生素E可以促進魚類肝胰臟的生長發(fā)育。腸道在魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收上起著重要的作用,腸道的生長發(fā)育狀況與其消化吸收功能密切相關(guān)[21]。腸道重量和蛋白質(zhì)含量通?？梢杂脕矸从衬c道的生長發(fā)育狀況。本研究發(fā)現(xiàn),當維生素E含量達到1 257 mg/kg時,幼建鯉的腸道重量和蛋白質(zhì)含量達到最大,且比NRC推薦量組分別提高20.41%和28.24%。可見,適宜高水平維生素E可以促進魚類消化器官的生長發(fā)育。

3.3 高水平維生素E對幼建鯉消化吸收能力的影響

消化酶在魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化中發(fā)揮著重要作用[9]。魚類消化酶主要由胰腺分泌后進入腸道發(fā)揮消化作用,因此腸道消化酶活力可以反映魚類的消化能力[8]。維生素 E含量為1 257 mg/kg組與NRC推薦量組相比,腸道胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶活力分別提高38.96%、32.61%和9.57%。這說明適宜高水平維生素E可以提高魚類消化能力。何敏等[4]在斑點叉尾鮰上的研究也發(fā)現(xiàn)維生素E能夠增加斑點叉尾鮰胃腸道蛋白酶以及脂肪酶活力,本試驗結(jié)果與其一致。

腸道是魚類吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所[9],腸道皺襞高度可反映魚類腸道吸收面積,因此其可作為水生動物腸道吸收能力的重要標識[22]。目前未見維生素E影響魚類腸道皺襞高度的研究報道,但研究發(fā)現(xiàn)泛酸[13]和硫胺素[14]能顯著增加建鯉的腸道皺襞高度。本研究發(fā)現(xiàn),維生素E含量為1 257 mg/kg組與NRC推薦量組相比,幼建鯉前、中和后腸皺襞高度分別提高10.85%、7.48%和6.24%。這說明適宜高水平維生素E可以通過提高腸道皺襞高度來提高魚類腸道的吸收能力。

魚類腸道刷狀緣酶如堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶等參與了營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[9]。堿性磷酸酶與脂類、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有關(guān),其活力被認為是魚類對營養(yǎng)物質(zhì)吸收強度的標識[23]；而Na+,K+-ATP酶活力可反映小腸黏膜對氨基酸的吸收能力[24]。目前未見維生素E影響魚類腸道刷狀緣酶活力的研究,但Wen等[13]和 Huang等[14]的研究分別發(fā)現(xiàn)泛酸和硫胺素能顯著增加建鯉的堿性磷酸酶及Na+,K+-ATP酶活力。本試驗發(fā)現(xiàn),維生素E含量為1 257 mg/kg組與NRC推薦量組相比,腸道堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶活力分別提高26.06%和35.48%,說明適宜高水平維生素E增強了魚類腸道的吸收能力。

4 結(jié) 論

①適宜高水平維生素E能促進幼建鯉生長,其促生長作用與提高攝食量和降低飼料系數(shù)有關(guān)。

②適宜高水平維生素E提高了幼建鯉消化吸收能力,消化能力的提高與其促進消化器官生長發(fā)育,提高蛋白酶、脂肪酶活力有關(guān)；吸收能力的提高與腸道皺襞高度和刷狀緣酶(堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶)活力的增加有關(guān)。

③以增重為標識,根據(jù)二次曲線法確定幼建鯉飼料中維生素E最適水平為1 106 mg/kg。

[1] POSTON H A,COMBS G F,LEIBOVITZ L.Vitamin E and selenium interrelations in the Atlantic salmon:gross,histological,and biochemical deficiency signs[J].Journal of Nutrition,1976,106:892-904.

[2] WATANABE T,HIBIYA T.Effects of α-tocopherol deficiency on carp[J].Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries,1970,36:623-630.

[3] GALAZ G B,KIM S S,LEE K J.Effects of different dietary vitamin E levels on growth performance,non-specific immune responses,and disease resistance against Vibrio anguillarum in Parrot fish(Oplegnathus fasciatus)[J].Asian-Australasian Journal of Animal Science,2010,23(7):916-923.

[4] 何敏,汪開毓,張宇,等.維生素E對斑點叉尾魚回生長性能和消化酶活性的影響[J].水產(chǎn)學報,2009,33(2):288-294.

[5] LIM C,YILDIRIM-AKSOY M,LI M H,et al.Influence of dietary levels of lipid and vitamin E on growth and resistance of Nile tilapia to Streptococcus iniae challenge[J].Aquaculture,2009,298:76-82.

[6] HAKIM Y,UNI Z,HULATA G,et al.Relationship between intestinal brush border enzymatic activity and growth rate in tilapias fed diets containing 30%or 48%protein[J].Aquaculture,2006,257:420-428.

[7] GARC ìA-GASCA A,GALAVIZ M A,GUTIé RREZ J N,et al.Development of the digestive tract,trypsin activity and gene expression in eggs and larvae of the bullseye puffer fish Sphoeroides annulatus[J].Aquaculture,2006,251:366-376.

[8] CAHU C,R?NNESTAD I,GRANGIER V,et al.Expression and activities of pancreatic enzymes in developing sea bass larvae(Dicentrarchus labrax)in relation to intact and hydrolyzed dietary protein involvement of cholecystokinin[J]. Aquaculture,2004,238:295-308.

[9] SILVA F C P,NICOLI J R,ZAMBONINO-INFANTE J L,et al.Influence of partial substitution of dietary fish meal on the activity of digestive enzymes in the intestinal brush border membrane of gilthead sea bream,Sparus aurata and goldfish,Carassius auratus[J].Aquaculture,2010,306:233-237.

[10] NRC.Nutrient requirements of fish[S].Washington,D.C.:National Academy Press,1993.

[11] 桂遠明.水產(chǎn)動物機能學實驗[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2004:116-119.

[12] 施特爾馬赫.酶的測定方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1992:123-125.

[13] WEN Z P,ZHOU X Q,FENG L,et al.Effect of dietary pantothenic acid supplement on growth,body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)[J].Aquaculture Nutrition,2009,15:470-476.

[14] HUANG H H,FENG L,LIU Y,et al.Effects of dietary thiamin supplement on growth,body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)[J].Aquaculture Nutrition,2010,published online,doi:10.1111/j.1365-2095.2010.00756.x.

[15] SAU S K,PAUL B N,MOHANTA K N,et al.Dietary vitamin E requirement,fish performance and carcass composition of rohu(Labeo rohita)fry[J].Aquaculture,2004,240:359-368.

[16] PAUL B N,SARKAR S,MOHANTY S N.Dietary vitamin E requirement of mrigal,Cirrhinus mrigala fry[J].Aquaculture,2004,242:529-536.

[17] R?NNESTAD I,TONHEIM S K,FYHN H J,et al.The supply of amino acids during early feeding stages of marine fish larvae:a review of recent findings[J].Aquacultrue,2003,227:147-164.

[18] 耿毅,汪開毓,周震.維生素E缺乏對鯉骨骼肌損傷的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2006,18(4):267-271.

[19] TAKEUCHI T,WATANABE K,SATO H,et al.Requirement of grass carp fingerling for α-tocopherol[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1992,58(9):1743-1749.

[20] 周筱丹,董曉芳,佟建明.維生素E的生物學功能和安全性評價研究進展[J].動物營養(yǎng)學報,2010,22(4):817-822.

[21] EL-BAKARY N E R,EL-GAMMAL H L.Comparativehistological,histochemical and ultrastructrural studies on the proximal intestine of flathead grey mullet(Mugil cephalus)and sea bream(Sparus aurata)[J].World Applied Sciences Journal,2010,8:477-485.

[22] OLLI J J,KROGDAHL A.Nutritive value of four soybean products as protein sources in diets for rainbow trout(Oncorhynchus mykiss,Walbaum)reared in fresh water[J].Acta Agriculturae Scandinavica Section A:Animal Science,1994,44(3):185-192.

[23] TENGJAROENKUL B,SMITH B J,CACECI T,et al.Distribution of intestinal enzyme activities along the intestinal tract of cultured Nile tilapia,Oreochromis niloticus L.[J].Aquaculture,2000,182:317-327.

[24] VEILLETTE P A,GRAHAM Y.Temporal changes in intestinal Na+,K+-ATPase activity and in vitro responsiveness to cortisol in juvenile chinook salmon[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular＆Integrative Physiology,2004,138(3):297-303.