白晶 鐘小寧 唐海娟 何志義 張建全 鄧靜敏

整合素（integrin）是細(xì)胞粘附分子中一類重要的細(xì)胞表面受體家族，由α和β兩個(gè)亞基組成的跨膜異二聚體，α和β亞基均由長(zhǎng)的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和短的胞內(nèi)區(qū)組成，主要介導(dǎo)信息從細(xì)胞外基質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)傳遞，調(diào)控細(xì)胞與胞外基質(zhì)的粘附和細(xì)胞間的粘附，并參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、伸展與遷移等[1]。因此整合素的信息傳遞在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞失控制性生長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞的去分化與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用[2]。但是，對(duì)于整合素的細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)的具體過(guò)程及眾多整合素相關(guān)蛋白的功能目前仍不十分清楚。整合素α5β1是整合素分子家族中重要的亞單位，能與不同的亞單位結(jié)合，構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的絕大多數(shù)受體。近年研究[3,4]顯示整合素α5β1的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的轉(zhuǎn)移性、浸潤(rùn)性和低分化趨向密切相關(guān)，是NSCLC患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracelluar signal-regulated protein kinase,ERK）通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，可將胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，介導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)（如增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等）的過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。整合素α5β1是否通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路調(diào)控了肺癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過(guò)程，目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用整合素α5/β1 siRNA雙鏈及ERK抑制劑PD98095干預(yù)人肺癌細(xì)胞A549，旨在研究整合素α5β1蛋白表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移能力的影響及其細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人肺癌細(xì)胞株A549由華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，OligofectamineTM和Opti-MEMI購(gòu)自Carlsbad公司， 整合素α5/β1小片段干擾核糖核酸（small interfering RNA, siRNA）雙鏈、兔抗人整合素α5、β1單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，新生牛血清和Trizol試劑盒購(gòu)自Gibco公司，Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自晶美生物工程有限公司，碘化丙錠（propidium iodide, PI）購(gòu)自Sigma公司，二甲基亞砜及噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT）均購(gòu)自Clontech公司，ERK抑制劑（PD98095）購(gòu)自美國(guó)CST公司，兔抗人磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）單克隆抗體、小鼠抗人ERK1/2單克隆抗體，小鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotease, MMP）-9單克隆抗體，兔抗人半胱天冬酶（caspase）-3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R＆D公司。TaqDNA聚合酶、莫洛尼(氏)鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus, M-MLV）、寡脫氧胸苷酸、核糖核酸酶抑制劑及瓊脂糖均購(gòu)自美國(guó)Promega公司，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）試劑盒，整合素α5、整合素β1及內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH）引物購(gòu)自日本Takara公司，增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Plierce公司。PCR和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）圖像由Bio-Rad公司Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)掃描，圖像分析用Quantity One（version 4.6）分析軟件完成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組 A549細(xì)胞用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法特異性抑制整合素α5β1表達(dá)。利用ERK抑制劑PD98059抑制ERK的磷酸化。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞接種，待細(xì)胞融合度達(dá)95%時(shí)，進(jìn)行干預(yù)。將細(xì)胞分為4組：①未轉(zhuǎn)染組：A549細(xì)胞不加任何干預(yù)；②脂質(zhì)體組：A549細(xì)胞與Oligofectamine脂質(zhì)體按比例混合；③整合素α5/β1 siRNA轉(zhuǎn)染組：整合素α5和β1 siRNA與Oligofectamine脂質(zhì)體按比例混合經(jīng)Opti-MEMI稀釋，加入培養(yǎng)好的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染步驟按Santa Cruz公司說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)6 h后，在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)熒光素異硫氰酸酯（FITC）標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。然后改為10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h后應(yīng)用RT-PCR和Werstern blot法檢測(cè)RNA干擾效果；④PD98059組：A549細(xì)胞加入PD98059 10 μmol/L培養(yǎng)24 h。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.3 RT-PCR和Werstern blot法檢測(cè)A549細(xì)胞中整合素α5β1蛋白和mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后分別提取總RNA、總蛋白。

首先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后PCR擴(kuò)增。整合素α5基因片段，上游引物序列為5′-TCTGCCTCAATG CTTCTGG-3′，下游引物序列為5′-GTTGAGAGCGATG TGAATCG-3′，擴(kuò)增片段248 bp。整合素β1基因片段，上游引物序列為5′-ACACGTCTCTCTCTGTCG-3′，下游引物序列為5′-CAGTTGTTACGGCACTCT-3′，擴(kuò)增片段158 bp。GAPDH作為內(nèi)參照，上游引物序列為：5'-TCCCATCACCATCTTCCA-3'，下游引物序列為：5'-CATCACGCCACAGTTTCC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段376 bp。PCR反應(yīng)條件設(shè)置如下：94oC預(yù)變性2 min，94oC變性60 s，58oC退火45 s，72oC延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。各取5 μL PCR產(chǎn)物與2 μL溴酚藍(lán)混合后上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。紫外光下觀察并照相，采用軟件分析目的基因和GAPDH條帶的光密度（A）值，以同一管中目的基因和GAPDH產(chǎn)物條帶A值之比作為反映目的基因mRNA表達(dá)水平的數(shù)據(jù)。

提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)后，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度以保證每個(gè)上樣孔總蛋白量一致。蛋白變性、上樣，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)膜，孵育一抗（稀釋比例1:1,000）、二抗（稀釋比例1:2,000），ECL發(fā)光，膠片曝光。以β-actin作為內(nèi)參照。膠片掃描并照相，測(cè)定各條帶灰度值。以目的蛋白和β-actin條帶A值之比作為反映目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)ERK1/2蛋白表達(dá)的影響 收集細(xì)胞，采用Western blot檢測(cè)ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)，一抗ERK1/2、p-ERK1/2按1:1,000稀釋，方法同前。曝光后X光片用凝膠圖像分析軟件掃描，測(cè)定蛋白條帶的灰度值。結(jié)果均用實(shí)際值與內(nèi)參β-actin的比值（A%）表示，并計(jì)算ERK磷酸化，即p-ERK1/2蛋白占ERK1/2蛋白表達(dá)的百分率（%）。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 96孔板內(nèi)的A549培養(yǎng)結(jié)束4 h前，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h后去培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜充分溶解結(jié)晶物，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度A值。

1.6 Annexin-V FITC PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液漂洗兩次，加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫作用15 min，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞百分率（Annexin V-FITC陽(yáng)性，PI陰性）。

1.7 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞中caspase-3、 MMP-9蛋白的表達(dá) 每孔取20 μg總蛋白加入等體積的上樣緩沖液，煮沸變性10 min后，進(jìn)行制膠、12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，泳閉，經(jīng)電轉(zhuǎn)印將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后，加入一抗（caspase-3、 MMP-9均按1:1,000稀釋），4oC孵育過(guò)夜，漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（1:2,000稀釋），室溫?fù)u床上孵育2 h，充分漂洗后按ECL發(fā)光試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，曝光后X光片用凝膠圖像分析軟件掃描，測(cè)定蛋白條帶的灰度值。結(jié)果均用實(shí)際值與內(nèi)參β-actin的比值（A%）表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，所有數(shù)值以Mean±SD表示。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，任意兩組均數(shù)之間的比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 整合素α5β1 siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的證實(shí) 經(jīng)FITC標(biāo)記的整合素α5β1 siRNA與A549共培養(yǎng)6 h后，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均有染色，部分細(xì)胞核核仁染色突出，有明亮的熒光（圖1）。

2.2 轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中整合素α5β1蛋白和mRNA表達(dá)受抑制 如圖2所示，以β-actin為內(nèi)參測(cè)定各組灰度比值，與脂質(zhì)體組整合素α5蛋白（0.891±0.063）、整合素β1蛋白（0.963±0.082）比較，轉(zhuǎn)染后整合素α5、β1蛋白表達(dá)（分別為0.227±0.071、0.375±0.028）明顯降低。脂質(zhì)體組與未轉(zhuǎn)染組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示整合素α5/β1 siRNA雙鏈轉(zhuǎn)染24 h后對(duì)整合素α5β1蛋白表達(dá)有抑制作用。采用RT-PCR檢測(cè)是否在整合素α5β1蛋白明顯降低的同時(shí)伴有整合素α5β1 mRNA的表達(dá)變化。整合素α5β1 mRNA的表達(dá)與整合素α5β1蛋白表達(dá)具有相似的趨勢(shì)，與脂質(zhì)體組整合素α5 mRNA（0.78±0.12）、整合素β1 mRNA（0.56±0.09）比較，轉(zhuǎn)染組整合素α5 mRNA、β1 mRNA（分別為0.29±0.03、0.17±0.02）表達(dá)均明顯降低。脂質(zhì)體組與未轉(zhuǎn)染組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染對(duì)各組細(xì)胞中β-actin的蛋白及GAPDH的mRNA表達(dá)無(wú)任何影響。干擾具有特異性。

2.3 轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中ERK磷酸化受抑制 與脂質(zhì)體組（分別為0.272±0.015、0.217±0.006）比較，轉(zhuǎn)染整合素α5/β1 siRNA雙鏈24 h后ERK1/2蛋白（0.089±0.017）和p-ERK1/2蛋白（0.042±0.017）表達(dá)水平均明顯降低，ERK磷酸化水平降低（30.96±3.07）%。脂質(zhì)體組與未轉(zhuǎn)染組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示抑制整合素α5/β1蛋白和mRNA表達(dá)的同時(shí)可以明顯降低ERK磷酸化，提示整合素α5/β1與ERK1/2信號(hào)通路之間具有密切關(guān)系（圖3）。

2.4 整合素α5/β1介導(dǎo)ERK1/2信號(hào)通路抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡 與未轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體組比較，轉(zhuǎn)染整合素α5/β1 siRNA雙鏈24 h后A549細(xì)胞增殖受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而在未轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體組A549細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。未轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞增殖可以被ERK抑制劑PD98059所抑制。與未轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體組比較，轉(zhuǎn)染整合素α5/β1 siRNA雙鏈24 h后A549早期凋亡細(xì)胞百分率明顯增高，而在未轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體組A549早期凋亡細(xì)胞百分率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。未轉(zhuǎn)染組中早期凋亡細(xì)胞百分率同樣可以被ERK抑制劑PD98059所提高，提示整合素α5/β1可能介導(dǎo)ERK1/2信號(hào)通路抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡（表1）。

2.5 整合素α5/β1介導(dǎo)ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)caspase-3表達(dá)增強(qiáng) 如圖4所示，轉(zhuǎn)染后caspase-3蛋白（1.671±0.027）表達(dá)增高，而未轉(zhuǎn)染組（0.869±0.022）和脂質(zhì)體組（0.851±0.067）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PD98059組caspase-3蛋白（1.604±0.011）表達(dá)也增高。

圖 1 轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞（A：相差顯維鏡，×200；B：熒光顯維鏡，×200）。Fig 1 A549 cells were transfected and watched (A: phase contrast microscopy, magnification ×200; B: microscopy,magnification ×200).

圖 2 整合素α5/β1 siRNA抑制A549細(xì)胞中整合素α5β1蛋白和mRNA的表達(dá)（1.未轉(zhuǎn)染組；2.脂質(zhì)體組；3.整合素α5/β1 siRNA轉(zhuǎn)染組）。A：A549細(xì)胞中整合素α5β1的Western blot檢測(cè)結(jié)果，以β-actin作為內(nèi)參；B：柱狀分析圖，結(jié)果顯示整合素α5/β1 siRNA抑制整合素α5β1的蛋白表達(dá)；C：A549細(xì)胞中整合素α5β1的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，以GAPDH作為內(nèi)參；D：柱狀分析圖，結(jié)果顯示整合素α5/β1 siRNA抑制整合素α5β1 mRNA表達(dá)。* P＜0.05.Fig 2 The inhibition of integrin α5β1 protein and mRNA in A549 by integrin α5β1 small interfering RNA (1. Untransfection group; 2.Lipofectamine group; 3. Integrin α5β1 siRNA-transfected group). A: The expression of integrin α5β1 protein in A549 detected by Western blot,β-actin served as internal control; B: The densitometric analysis of integrin α5β1 shows the integrin α5β1 small interfering RNA suppressed the expression of integrin α5β1 protein; C: The expression of integrin α5β1 mRNA in A549 detected by RT-PCR, GAPDH served as internal control; D:The densitometric analysis of integrin α5β1 shows the integrin α5β1 small interfering RNA suppressed the expression of integrin α5β1 mRNA.* P＜0.05.

圖 3 整合素α5/β1 siRNA抑制A549細(xì)胞中ERK磷酸化（1.未轉(zhuǎn)染組；2.脂質(zhì)體組；3.整合素α5/β1 siRNA轉(zhuǎn)染組）。A：A549細(xì)胞中ERK1/2和p-ERK1/2的Western blot檢測(cè)結(jié)果，以β-actin作為內(nèi)參；B：柱狀分析圖，結(jié)果顯示整合素α5/β1 siRNA可以通過(guò)抑制ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表達(dá)來(lái)抑制ERK磷酸化。* P＜0.05。Fig 3 The inhibition of the phosphorylated ratio of ERK in A549 by integrin α5β1 small interfering RNA (1. Untransfection group; 2. Lipofectamine group; 3. Integrin α5β1 siRNA-transfected group). A: The expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 in A549 detected by Western blot, β-actin served as internal control; B: The densitometric analysis shows the integrin α5β1 small interfering RNA could suppress the phosphorylated ratio of ERK by down-regulating the expression of ERK 1/2 and p-ERK1/2 proteins. * P＜0.05.

圖 4 整合素α5/β1 siRNA對(duì)A549細(xì)胞中caspase-3表達(dá)的影響（1.未轉(zhuǎn)染組；2.脂質(zhì)體組；3. 整合素α5/β1 siRNA轉(zhuǎn)染組；4. PD98059組）。A：A549細(xì)胞中caspase-3的Western blot檢測(cè)結(jié)果，以β-actin作為內(nèi)參；B：柱狀分析圖，結(jié)果顯示整合素α5/β1 siRNA促進(jìn)caspase-3蛋白表達(dá)。* P＜0.05。Fig 4 Effect of integrin α5β1 small interfering RNA on caspase-3 protein in A549. (1. Untransfection group; 2. Lipofectamine group; 3. Integrin α5β1 siRNA-transfected group; 4. PD98059 group). A: The expression of caspase-3 in A549 detected by Western blot, β-actin served as internal control; B: The densitometric analysis of caspase-3 shows the integrin α5β1 small interfering RNA could up-regulate the expression of caspase-3. * P＜0.05.

表 1 整合素α5/β1 siRNA對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響Tab 1 Effect of integrin α5β1 small interfering RNA on the proliferation and apoptosis of A549 cells

2.6 整合素α5/β1介導(dǎo)ERK1/2信號(hào)通路抑制MMP-9蛋白的表達(dá) 如圖5所示，轉(zhuǎn)染后MMP-9蛋白（0.207±0.020）表達(dá)下降，而未轉(zhuǎn)染組（0.912±0.041）和脂質(zhì)體組（0.920±0.087）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PD98059組MMP-9蛋白（0.186±0.033）表達(dá)也降低。

圖 5 整合素α5/β1 siRNA對(duì)A549細(xì)胞中MMP-9蛋白表達(dá)的影響（1. 未轉(zhuǎn)染組；2. 脂質(zhì)體組；3. 整合素α5/β1 siRNA轉(zhuǎn)染組；4. PD98059組）。A：A549細(xì)胞中MMP-9的Western blot檢測(cè)結(jié)果，以β-actin作為內(nèi)參；B：柱狀分析圖，結(jié)果顯示整合素α5/β1 siRNA抑制MMP-9蛋白表達(dá)。* P＜0.05.Fig 5 Effect of integrin α5β1 small interfering RNA on MMP-9 protein in A549 (1. Untransfection group; 2. Lipofectamine group; 3. Integrin α5β1 siRNA-transfected group; 4. PD98059 group ). A: The expression of MMP-9 in A549 detected by Western blot, β-actin served as internal control; B: The densitometric analysis of MMP-9 shows the integrin α5β1 small interfering RNA could suppress the expression of MMP-9.* P＜0.05.

3 討論

整合素是由α和β兩條鏈以共價(jià)鍵連接構(gòu)成的細(xì)胞表面受體家族，以異二聚體的形式表達(dá)于細(xì)胞表面.不僅可以通過(guò)識(shí)別細(xì)胞外基質(zhì)的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）序列介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附，與免疫球蛋白超家族分子結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附，還可以雙向轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)，直接影響細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)、增殖、分化以及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。

Adachi等[3]的研究顯示NSCLC組織中整合素α5β1的高表達(dá)與腫瘤分級(jí)負(fù)相關(guān)，低分化NSCLC中的整合素α5β1表達(dá)明顯高于高分化NSCLC，且整合素α5β1高表達(dá)者的生存期明顯低于表達(dá)正常者。Oshita等[4]的研究也表明在NSCLC組織中，整合素α5β1和p53是影響預(yù)后的最主要危險(xiǎn)因素。因此，整合素α5β1的高表達(dá)可能在NSCLC生長(zhǎng)、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的調(diào)控中起到重要作用。本組研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染整合素α5/β1 siRNA雙鏈后A549細(xì)胞增殖受到抑制，早期凋亡百分率增加，MMP-9蛋白表達(dá)下降提示整合素α5β1參與調(diào)控肺癌A549細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，整合素α5/β1 siRNA雙鏈通過(guò)抑制整合素α5/β1蛋白和mRNA表達(dá)抑制肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。

廣泛存在于腫瘤細(xì)胞表面的整合素受體及其引發(fā)的異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制在腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)及細(xì)胞的增殖和凋亡中起著重要作用[6,7]。以整合素為靶點(diǎn)的藥物也正在進(jìn)行[8]。整合素α5β1是整合素分子家族中重要的亞單位，在肺癌細(xì)胞的去分化與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[9]。然而在整合素活性調(diào)節(jié)機(jī)制中，還有很多沒(méi)有闡明的問(wèn)題，如整合素介導(dǎo)的由外而內(nèi)的信號(hào)傳遞和由內(nèi)而外的信號(hào)傳遞之間有什么相互關(guān)系？細(xì)胞通過(guò)哪些通路和分子來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)整合素活性的調(diào)控？為此，我們選用整合素α5/β1 siRNA雙鏈和ERK抑制劑PD98095干預(yù)人肺癌細(xì)胞A549，旨在探討整合素α5/β1是否介導(dǎo)了ERK1/2信號(hào)通路影響A549細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。研究顯示，轉(zhuǎn)染整合素α5/β1 siRNA雙鏈后A549細(xì)胞的ERK磷酸化明顯受到抑制，提示整合素α5β1與ERK1/2 信號(hào)通路密切相關(guān)，進(jìn)一步研究顯示ERK抑制劑PD98059同樣能抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)早期凋亡和抑制MMP-9蛋白表達(dá)，提示ERK1/2信號(hào)通路同樣參與調(diào)控了肺癌A549細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，整合素α5β1可能介導(dǎo)ERK1/2信號(hào)通路調(diào)控A549細(xì)胞的生長(zhǎng)與遷移。國(guó)外研究[10,11]顯示整合素α5β1的高表達(dá)狀態(tài)與慢性髓細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia, CML）的發(fā)病息息相關(guān)，通過(guò)FAK-MAPK或PI3K-AKT信號(hào)途徑上調(diào)核內(nèi)某些基因的表達(dá)，促使細(xì)胞發(fā)生白血病轉(zhuǎn)化、異常增殖和凋亡受抑。有研究[9,12]顯示整合素β1通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路上游的FAK調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖。α-倒捻子素可以抑制由佛波酯誘導(dǎo)活化的整合素α3后通過(guò)FAK-ERK-NF-κB信號(hào)途徑調(diào)控MMP-2和MMP-9的表達(dá)，從而抑制A549細(xì)胞遷移[13]。骨橋蛋白可以識(shí)別整合素αvβ3，啟動(dòng)FAK-PI3K-ERK細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移[14]。因此，ERK1/2信號(hào)通路在調(diào)控A549細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，阻斷這些信號(hào)通路上游的整合素，其介導(dǎo)的生長(zhǎng)、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移必然受到影響。

此外，我們同時(shí)亦發(fā)現(xiàn)整合素α5/β1 siRNA雙鏈及ERK抑制劑PD98059均可以使A549細(xì)胞中caspase-3表達(dá)增高，提示整合素α5β1可能介導(dǎo)了ERK1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)caspase-3表達(dá)增高，從而促使凋亡的發(fā)生，阻斷整合素α5β1有可能防止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移以及耐藥的發(fā)生。已有研究[15]顯示整合素α5β1拮抗劑在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)治療中有明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞老化的作用。

總之，我們的研究證實(shí)，在A549細(xì)胞中整合素α5β1可能通過(guò)誘導(dǎo)ERK的磷酸化，進(jìn)而抑制caspase-3蛋白和促進(jìn)MMP-9蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與遷移作用。本研究揭示了整合素α5β1在A549細(xì)胞中的作用及相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制，為以整合素為靶點(diǎn)的肺癌分子治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。