秦安東 周涯 盛美霞 費(fèi)廣茹 任濤 徐林

MicroRNAs（miRNAs）是一組內(nèi)源性、長(zhǎng)約22 nt的非編碼小RNA，其主要在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）結(jié)合，導(dǎo)致目的mRNA的降解或蛋白質(zhì)翻譯抑制，而負(fù)調(diào)控目的基因的表達(dá)[1]。miRNAs參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等多種生物學(xué)進(jìn)程。近年來(lái)的研究[2,3]表明，miRNAs的突變和表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可發(fā)揮癌基因和抑癌基因的作用，促進(jìn)或抑制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。

肺癌是最常見的惡性腫瘤，高居惡性腫瘤死亡率的首位[4]。近年來(lái)，大量的研究[5-8]顯示，miRNAs與肺癌的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)。miR-155是miRNAs家族中的重要成員，有研究[8-10]報(bào)道，與正常肺組織相比，miR-155在肺癌組織中表達(dá)異常，與肺癌的預(yù)后相關(guān)。但目前關(guān)于miR-155與肺癌具體關(guān)系的研究還比較少。我們通過(guò)觀察體外轉(zhuǎn)染miR-155對(duì)人肺癌95D細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究miR-155與肺癌的關(guān)系提供前期理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人源性肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95D，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化所。

1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基 （Hyclone）；優(yōu)質(zhì)胎牛血清FBS（Solarbio）；hsa-miR-155 mimics、hsa-miR-155 mimics negative control（上海生工生物工程有限公司合成）；FuGENE? HD Transfection Reagent（Roche）；Trizol試劑（Invitrogen, USA）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）；TaqMan? MicroRNA Assay Kit（Ambion）；MTT試劑盒（Sigma）；兔抗人SOS1單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology）；PI（propidium iodide）（Abcam）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人肺癌95D細(xì)胞在含10%FBS（胎牛血清）、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素、1 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640的培養(yǎng)基中，37oC、5%CO2全濕度培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組：①空白對(duì)照組（Mock）：僅加入FuGENE? HD Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑；②陰性對(duì)照組（miR-155 cont）：轉(zhuǎn)染miR-155 mimics negative control；③ miR-155轉(zhuǎn)染組 （miR-155）：轉(zhuǎn)染miR-155 mimics （40 pM, 80 pM, 160 pM）。轉(zhuǎn)染方法按照FuGENE?HD Transfection Reagent說(shuō)明書操作。

1.4 RT-PCR檢測(cè)miR-155的表達(dá) 收集上述轉(zhuǎn)染48 h后的95D細(xì)胞，Trizol一步法提取總RNA，用miR-155發(fā)夾狀引物按試劑盒說(shuō)明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；應(yīng)用LightCycler（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,Germany）定量PCR儀對(duì)miR-155成熟體進(jìn)行定量檢測(cè)。miR-155成熟體TaqMan探針由TaqMan? MicroRNA Assay Kit提供，PCR反應(yīng)條件按試劑盒說(shuō)明書操作。在擴(kuò)增結(jié)束后將每對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%凝膠電泳分析，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和靈敏度。miR-155成熟體相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算：特異基因的DNA含量/內(nèi)參GAPDH的含量=目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 MTT法檢測(cè)miR-155對(duì)95D細(xì)胞的增殖抑制 收集上述各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為（4-5）×105/mL接種于96孔培養(yǎng)板（200 μL/孔），每組細(xì)胞設(shè)10個(gè)平行孔。37oC、5%CO2培養(yǎng)72 h，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，待結(jié)晶物充分溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處各孔OD值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布 離心收集各組95D細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入預(yù)冷70%乙醇，于4oC固定過(guò)夜，PBS洗滌收集細(xì)胞，PBS重懸（1×106個(gè)/mL），吸取100 μL細(xì)胞懸液，加RNase A（100 μg/mL）和PI（50 μg/mL），4oC避光孵育30 min，PBS洗滌重懸后用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的分布情況。

1.7 Western blot檢測(cè)SOS1蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，Bradford法蛋白定量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將電泳分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（14 V、80 min），5%脫脂牛奶封閉，加兔抗人SOS1單克隆抗體（1:200稀釋），4oC過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1:2,000稀釋），37oC，孵育1 h，TBST緩沖液充分洗膜3次，每次10 min，再用TBS洗膜1次，10 min，發(fā)光壓片顯色，以β-actin作為內(nèi)參，分析結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 miR-155在95D細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平 為了檢測(cè)miR-155的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后48 h用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)miR-155成熟體的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與Mock組及miR-155 cont組比較，miR-155轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞miR-155的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）（圖1），結(jié)果表明miR-155轉(zhuǎn)染效率良好。

2.2 miR-155轉(zhuǎn)染對(duì)95D細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響 miR-155轉(zhuǎn)染48 h后，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Mock組和miR-155 cont組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，與Mock和miR-155 cont組相比，miR-155轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)生明顯變化：數(shù)目減少，細(xì)胞皺縮變圓，貼壁不牢，部分脫落（圖2A），且具有劑量依賴性，且結(jié)果顯示miR-155轉(zhuǎn)染劑量為80 pM和160 pM時(shí)，兩者對(duì)95D細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用無(wú)明顯差異，在后續(xù)的研究中均采用80 pM的劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MTT結(jié)果也表明，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-155能明顯抑制95D細(xì)胞的增殖（P＜0.05）（圖2B）。

圖 1 RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后人肺癌95D細(xì)胞miR-155的相對(duì)表達(dá)水平Fig 1 Relative miR-155 expression in human lung cancer 95D cells transfected with miR-155 mimics detected by RT-PCR

圖 2 miR-155轉(zhuǎn)染對(duì)人肺癌細(xì)胞95D體外生長(zhǎng)的影響。A：光學(xué)顯微鏡圖 （a: ×100; b: ×200; c: ×400）；B：MTT法檢測(cè)miR-155對(duì)人肺癌95D細(xì)胞增殖的抑制作用。Fig 2 The effects of miR-155 transfection on the growth of human lung cancer 95D cells in vitro. A: Observed under light microscope (a: ×100; b: ×200; c: ×400); B: Detected by MTT assay.

圖 3 miR-155轉(zhuǎn)染影響人肺癌95D細(xì)胞周期Fig 3 Effect of miR-155 over-expression on cell cyle profile in human lung cancer 95D cells

圖 4 miR-155轉(zhuǎn)染對(duì)人肺癌95D細(xì)胞SOS1表達(dá)的影響。A：TargetScan5.1軟件分析SOS1的3′UTR區(qū)域的hsa-miR-155的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)；B：miR-155轉(zhuǎn)染組與其它兩對(duì)照組的SOS1蛋白表達(dá)的Western blot印跡圖。Fig 4 Effect of miR-155 transfection on the expression of SOS1 in human lung cancer 95D cells. A: Complementarity site for miR-155 in the 3′UTR region of SOS1; B: The expression of SOS1 protein in human lung cancer 95D cell by Western blot.

2.3 miR-155轉(zhuǎn)染對(duì)95D細(xì)胞周期的影響 FACS檢測(cè)轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組細(xì)胞周期的分布，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-155的95D細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，而S期比例則明顯減少，與Mock組和miR-155 cont組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3），結(jié)果表明上調(diào)miR-155的表達(dá)可以誘導(dǎo)95D細(xì)胞的G0/G1期阻滯。

2.4 miR-155轉(zhuǎn)染對(duì)人肺癌95D細(xì)胞中SOS1蛋白表達(dá)的影響 Western blot分析顯示，與兩個(gè)對(duì)照組比較，miR-155可以明顯抑制95D細(xì)胞中SOS1蛋白的表達(dá)（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

近年來(lái)，miRNAs與肺癌的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。與肺癌相關(guān)的多種miRNAs相繼被發(fā)現(xiàn)，Hayashita等[11]首先在肺癌中檢測(cè)出miR-17-92簇的過(guò)表達(dá)，特別是小細(xì)胞肺癌，這提示它很可能具有癌基因功能。隨后的研究[12]顯示，miR-17-92基因簇的成員miR-17-5p可通過(guò)抑制其靶基因Rb2的表達(dá)，從而促進(jìn)肺上皮祖細(xì)胞的高度增殖和低分化，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性變和肺癌的發(fā)生。Zhang等[13]研究表明，miR-21在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中明顯上調(diào)，通過(guò)與抑癌基因PTEN的3′UTR端結(jié)合，下調(diào)PTEN的表達(dá)，阻止其翻譯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，Sun等[14]通過(guò)構(gòu)建表達(dá)miR-126的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到NSCLC A549細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)無(wú)論在體內(nèi)或體外miR-126的過(guò)表達(dá)均可下調(diào)EGFL7的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些研究表明，miRNAs是肺癌發(fā)生、發(fā)展的重要調(diào)控分子，具有癌基因或抑癌基因的作用。

miR-155位于BIC基因的第3個(gè)外顯子內(nèi)，其表達(dá)水平受到BIC基因表達(dá)和miRNAs本身加工的調(diào)控[15]，miR-155是一種多功能的miRNA，其表達(dá)水平的變化與多種腫瘤密切相關(guān)。在血液系統(tǒng)腫瘤中，miR-155在多種B細(xì)胞淋巴瘤中過(guò)表達(dá)，在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)水平最高[16,17]。Jiang等[18]最近的研究表明miR-155通過(guò)負(fù)調(diào)控腫瘤抑制基因socs1，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)為癌基因的作用。目前，miR-155在肺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的確切功能和機(jī)制仍不清楚。我們?cè)谘芯恐胁捎皿w外轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-155轉(zhuǎn)染人肺癌95D細(xì)胞，MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-155能明顯抑制人肺癌95D細(xì)胞的體外增殖。而新近的研究[19,20]結(jié)果表明miR-155與NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)性可能因肺癌的病理學(xué)類型而不同，在腺癌（adenocarcinomas, ACs）患者中，miR-155表達(dá)升高，預(yù)后較差；而對(duì)鱗癌（squamous cell carcinomas, SCCs）且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者分析表明，miR-155表達(dá)升高，患者的5年生存率卻明顯增加[20]。此外，Volinia等[21]發(fā)現(xiàn)miR-155在胰腺癌中表達(dá)下調(diào)。Dorsett等[22]研究顯示miR-155能通過(guò)與Aicda的3′UTR 結(jié)合，下調(diào)AID（activation-induced cytidine deaminase）的表達(dá)及依賴AID的Myc-Igh易位發(fā)生的頻率，從而降低細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。這些研究表明，miRNAs發(fā)揮癌基因或抑癌基因的功能可能因腫瘤的類型和病理學(xué)亞型不同而表現(xiàn)出功能的差異。FCM進(jìn)一步分析顯示，miR-155能誘導(dǎo)人肺癌95D細(xì)胞G0/G1期阻滯。此前的多項(xiàng)研究也顯示miRNAs能調(diào)控肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，Bandi等[23]發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-15a和miR-16的表達(dá)能將NSCLC細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。另一項(xiàng)研究[24]顯示，miR-107和miR-185可使肺癌H1299細(xì)胞和A549細(xì)胞停滯在G1期。

為了進(jìn)一步探討miR-155對(duì)人肺癌95D細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制機(jī)制，我們采用TargetScan5.1篩選發(fā)現(xiàn)，SOS1的3′UTR具有與miR-155互補(bǔ)的序列，SOS1可能是miR-155的靶基因，SOS1是許多生長(zhǎng)因子受體和粘附因子受體信號(hào)傳導(dǎo)的下游分子，是Ras信號(hào)途徑的一個(gè)重要分子，其活化能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和粘附。Timofeeva等[25]發(fā)現(xiàn)SOS1在前列腺癌中水平升高，下調(diào)前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145中SOS1的表達(dá)，細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力明顯減弱。我們通過(guò)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-155的人肺癌95D細(xì)胞SOS1表達(dá)水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-155能明顯下調(diào)人肺癌95D細(xì)胞SOS1表達(dá)，通過(guò)研究分析，我們推測(cè)miR-155很可能通過(guò)下調(diào)SOS1的表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯對(duì)人肺癌95D細(xì)胞的體外生長(zhǎng)發(fā)揮抑制作用，但是，miR-155對(duì)于肺癌生長(zhǎng)的作用和機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

總之，我們的研究表明miR-155可以明顯抑制人肺癌95D細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，這可能與與其抑制SOS1的表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，為深入研究miR-155在肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用提供了前期的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)可為臨床肺癌生物治療提供新的靶點(diǎn)和方向。