倫艷霞 （天津市海納德動物藥業(yè)有限公司 天津300456）

隨著人們對水產(chǎn)品需求的增加，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)從傳統(tǒng)的養(yǎng)殖模式向集約化、工廠化模式轉(zhuǎn)變。在集約化養(yǎng)殖模式中，大量人工飼料的投喂、有機(jī)肥料的施加、水產(chǎn)養(yǎng)殖動物排泄的糞便、死亡動植物的殘骸構(gòu)成了水體中有機(jī)物來源的主體，進(jìn)而使水體的理化條件不斷惡化。水體中氮素含量超標(biāo)，并積累了大量的氨氮、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)，最終給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。[1-2]生物脫氮技術(shù)以其無污染、脫氮徹底和安全等優(yōu)點被認(rèn)為是目前最經(jīng)濟(jì)、有效、可行性高的水體除氮技術(shù)。[3-4]

本實驗通過定向富集，從天津靜?？h某一常年養(yǎng)殖池塘中分離得到一株具有高效降解亞硝態(tài)氮能力的反硝化細(xì)菌，并在實驗室條件下，對該菌株的天然養(yǎng)殖水體中的反硝化特性進(jìn)行了研究，為在生產(chǎn)實踐中開發(fā)應(yīng)用反硝化細(xì)菌提供了有益的指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 菌種分離

從天津靜?？h某一常年養(yǎng)殖池塘中采集水樣，取1 mL水樣加入到裝有100 mL滅菌液的富集培養(yǎng)基中，置30℃、130 rpm環(huán)境中富集培養(yǎng)3～4天，待培養(yǎng)基渾濁；取1 mL培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋液分別涂布于溴百里酚培養(yǎng)基（BTB培養(yǎng)基），置30℃環(huán)境中培養(yǎng)1～2天，用接種環(huán)挑取不同形態(tài)單菌落于新的富集培養(yǎng)基中置30℃、130 rpm環(huán)境中震蕩過夜培養(yǎng)。重復(fù)劃線培養(yǎng)2～3次，直至平板菌落形態(tài)單一，無其他形態(tài)的菌落為止。挑選產(chǎn)氣快、氣泡多的菌株，進(jìn)一步檢測培養(yǎng)基中亞硝態(tài)氮和總氮的含量。篩選一株產(chǎn)氣快、可迅速降解亞硝態(tài)氮和總氮的菌株進(jìn)行實驗。

1.1.1 菌體形態(tài)和生理、生化鑒定依據(jù)文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

1.1.2 反硝化活性檢測。挑取單菌落于反硝化培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，按1%的接種量（前培養(yǎng)物OD600 nm為1）接種到裝有100 mL含有1.98 mg/L亞硝態(tài)氮的LB培養(yǎng)基中，置30℃，靜置密閉培養(yǎng)。第2天重新補(bǔ)加亞硝態(tài)氮至6.74 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔一定時間（2 h）取樣，測定培養(yǎng)基中剩余的C（NO2-）及菌體的濁度。

1.1.3 篩選出的菌株在天然養(yǎng)殖水體中的反硝化特性。

1.2 水樣采集

2010年7月8日從天津靜?？h某一養(yǎng)殖池塘于早上5～6點采集水樣；pH值為7.9，硝態(tài)氮濃度約為4.21 mg/L；亞硝態(tài)氮濃度約為0.08 mg/L；化學(xué)耗氧量COD為19.81～21.50 mg/L。

1.3 反硝化活性檢測

水樣經(jīng)脫脂棉過濾后分為兩份：一份加入NaNO2作為富含亞硝態(tài)氮的水樣；另一份加入NaNO2和KNO3作為同時富含兩種氮素的水樣，加入最適合的碳源（0.2 g/L乙醇），使其中的碳氮摩爾比達(dá)到10∶1，分裝于500 mL的血清瓶中。按1%的量加入純培養(yǎng)后的菌株，培養(yǎng)72 h后檢測水樣中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量。以不加菌的水樣作為對照。另一組不加碳源的水樣，考察碳源對菌株反硝化活性的影響。亞硝酸鹽采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法；硝態(tài)氮采用紫外分光光度法測定；總氮采用堿性過硫酸鉀法；CODMn采用酸性高錳酸鉀法；菌體量采用濁度法和平板計數(shù)法。

1.4 碳氮摩爾比試驗

水樣過濾后，加入不等量的最適合碳源（0.2 g/L乙醇），使其碳氮摩爾比分別為4.6∶1，8∶1，12∶1。按1%的量接入菌體，每天定時取樣，檢測水樣中的亞硝酸鹽的含量。

1.5 接菌量試驗

水樣過濾后，接入不等量的菌體，使菌濃度分別為3.0×106CFU/L、3.0×107CFU/L、3.0 ×108CFU/L、3.0 ×109CFU/L，72 h后檢測水樣中亞硝態(tài)氮含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離與鑒定

經(jīng)過富集、篩選和純化，得到一株在接種后72 h即產(chǎn)生大量氣泡、迅速降解亞硝態(tài)氮和總氮的菌株。該菌株為革蘭氏陽性菌、產(chǎn)芽孢，可進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵，接觸酶陽性，7%NaCl中生長，可水解淀粉和酪素，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌屬。

2.2 菌株在天然養(yǎng)殖水體中的反硝化特性

2.2.1 反硝化活性檢測 從表1中可以看出，由于硝態(tài)氮可以同時作為微生物生長的營養(yǎng)鹽和反硝化的電子供體被利用，所以無論是否添加碳源，水樣中的硝酸鹽都有一定程度的下降，未發(fā)生積累。對照水樣中的氮素含量在兩種情況下無明顯變化，說明水樣自身所含有的微生物不具有顯著的反硝化能力，不會對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。

接菌水樣在未添加碳源時，亞硝態(tài)氮的濃度由6.04 mg/L上升到6.31 mg/L，表明水樣中發(fā)生了微弱的反硝化作用。說明天然水樣中雖然含有一定量的有機(jī)質(zhì)，但它們主要是一些未被降解的或較難生物降解的有機(jī)物，難以被反硝化細(xì)菌作為碳源利用。添加碳源時，投菌水樣中的亞硝態(tài)氮降到了0.007 4 mg/L，幾乎被完全降解，降解速率達(dá)到0.1 mg/（L·h），同時血清瓶中檢測到有N2O產(chǎn)生。說明當(dāng)可利用碳源充足時，典型的養(yǎng)殖水環(huán)境即可滿足菌株進(jìn)行高效反硝化作用的要求，使亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為含氮氣，徹底脫離水體。這對于治理養(yǎng)殖水體的亞硝態(tài)氮污染是非常有利的。

表1 菌株在富含亞硝態(tài)氮的天然養(yǎng)殖水體中的反硝化活性

從表2中可以看出，不添加碳源時，投菌水樣中的硝態(tài)氮含量由43.20 mg/L下降到35.66 mg/L，而亞硝態(tài)氮含量由6.04 mg/L上升到10.36 mg/L。說明當(dāng)水體同時富含這兩種氮素時，菌株優(yōu)先利用硝態(tài)氮作為反硝化電子的供體，即硝酸鹽的還原先于亞硝酸鹽的還原。當(dāng)在水樣中添加乙醇時，硝態(tài)氮濃度降為2.25 mg/L，亞硝態(tài)氮濃度降為0.17 mg/L，降解率分別達(dá)到94.79%和97.75%。說明菌株雖然是采用亞硝酸鹽定向富集得到的，但它依然具有完整的反硝化酶系，且其硝酸鹽還原酶活性相當(dāng)高。

表2 菌株在富含硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的天然養(yǎng)殖水體中的反表2 硝化活性

兩次實驗結(jié)果表明該菌株不僅可應(yīng)用于富含亞硝態(tài)氮的水體，在同時富含硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的水體中也可快速將兩種氮素除去，具有廣泛的適用性。

2.2.2 碳氮摩爾比對反硝化作用的影響 水體中的C、N摩爾比是影響脫氮系統(tǒng)除氮效果的一個重要因素。無氧條件下，反硝化作用所需碳與硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮之和的理論比值為4.6∶1；在Bardenpho工藝中，為達(dá)到充分脫氮，COD/TKN應(yīng)大于10.0～11.1。丹麥的一些研究確定COD/TKN應(yīng)大于8.3～12.5。[6-8]當(dāng)碳氮摩爾比為4.6∶1時，水樣中亞硝態(tài)氮含量隨著接菌時間的增加逐漸升高；碳氮摩爾比為8.0∶1和12.0∶1的水樣，變化趨勢比較一致。在接菌的第2天亞硝態(tài)氮濃度達(dá)到一個極值，第3天迅速降到了最低，之后的10天亞硝態(tài)氮一直都維持在最低濃度，血清瓶中檢測到有N2O生成。這表明菌株在處理試驗所用水樣時，碳氮比為8.0∶1時即可達(dá)到良好的脫氮效果。

2.2.3 投菌濃度試驗 天然水體中存在著相當(dāng)數(shù)量的土著微生物，它們和試驗投加的菌體存在著相互競爭的關(guān)系。為了確保所投加的微生物能在天然水體中發(fā)揮應(yīng)有的反硝化作用，有必要從實際應(yīng)用的可操作性出發(fā)，確定合適的投菌濃度。

表3 接菌濃度對菌株反硝化特性的影響

由表3可知，隨著投菌量的增加，亞硝態(tài)氮的降解率逐漸升高；當(dāng)投菌濃度達(dá)到108CFU/L時，菌株即可在水體中發(fā)揮高效的反硝化作用。采用LB培養(yǎng)基，對天然水樣中的可培養(yǎng)中溫細(xì)菌進(jìn)行計數(shù)，測得微生物濃度約為1.12×108cfu/L。在這種培養(yǎng)條件下，淡水中僅有約0.25%的微生物可被檢測到，[9]說明水樣中實際的微生物濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于108cfu/L，即試驗投加的菌體數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于土著微生物，表明該菌株在天然水體中具有較強(qiáng)的生存能力和環(huán)境適應(yīng)能力。

目前該菌株已在國內(nèi)多個池塘養(yǎng)殖水進(jìn)行了試驗，均取得了良好的脫氮效果。芽孢桿菌具有很強(qiáng)的生命力和旺盛的繁殖能力，易于生產(chǎn)、運輸和保藏，能適應(yīng)各種不良的環(huán)境條件，因此該菌株具有開發(fā)成微生態(tài)制劑，應(yīng)用于污染水體生物脫氮的巨大潛力，前景十分廣闊?！?/p>

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