習(xí) 斌， 萬(wàn)登峰， 梁愛(ài)軍， 沈曉黎， 鄧志峰

近年來(lái)，由于極端天氣頻繁出現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間暴露在冷環(huán)境下可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生局部的凍傷，特別是四肢凍傷，有學(xué)者認(rèn)為暴露在冷環(huán)境下機(jī)體的認(rèn)知功能下降［1］，而對(duì)顱腦損傷后暴露于冷環(huán)境下血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接變化的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠顱腦損傷后給予4℃低溫環(huán)境，用干-濕重法測(cè)腦含水量和用鑭示蹤劑觀察腦損傷后血管緊密連接開(kāi)放狀態(tài)，探討大鼠腦損傷后暴露冷于環(huán)境對(duì)血腦屏障通透性的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇與分組 健康Sprague-Dawley大鼠(雌雄不限)，體重250～350g，共80只，隨機(jī)分為常溫對(duì)照組(20只)、冷環(huán)境對(duì)照組(20只)、傷后冷環(huán)境組(20只)、傷后常溫組(20只)。每組又按顱腦損傷后取斷頭標(biāo)本時(shí)間不同分為4個(gè)亞組:分別為第1天、第3天、第5天、第7天，每個(gè)亞組5只。

1.2 冷環(huán)境下腦損傷模型的制備 用10%的水合氯醛(0.35/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，麻醉后將其頭部固定于立體定向儀上，剪去頂部皮毛，消毒皮膚后沿中線右側(cè)切開(kāi)頭皮，分離骨膜顯露右頂骨，用牙科鉆于中線旁2mm、人字縫前2mm鉆孔，形成一直徑約5mm的骨窗，注意保持硬膜完整。采用改進(jìn) Feeney，s［2］自由落體打擊大鼠腦組織，定制打擊器導(dǎo)管引導(dǎo)重錘(40g)從25cm處自由落體，撞擊撞針，撞針下陷約2.5mm，致大鼠右頂葉腦損傷。傷后縫合頭皮。傷后常溫組:大鼠腦損傷后立即置于溫度25℃的室溫環(huán)境中正常喂養(yǎng)。傷后冷環(huán)境組:大鼠腦損傷后立即置于溫度為4℃的人工氣候箱，4h后重新放入25℃室溫正常喂養(yǎng)。常溫對(duì)照組:僅開(kāi)顱不致傷，置于25℃室溫正常喂養(yǎng)。冷環(huán)境對(duì)照組:僅開(kāi)顱不致傷，置于溫度為4℃的人工氣候箱，4h后重新放入25℃室溫正常喂養(yǎng)。

1.3 腦組織含水量的測(cè)量 各組均于致傷后第1天、第3天、第5天、第7天斷頭取腦，沿挫傷灶中央冠狀面取材(包括對(duì)側(cè)未損傷腦組織)，厚約2mm，切取腦組織即刻用10%福爾馬林液固定4h。剩下腦組織置于已稱重的帶蓋玻璃稱樣杯中，用電子分析天平稱濕重后置于110℃電熱恒溫干燥箱內(nèi)干燥至恒重為止，稱量干重，按Elliot公式計(jì)算含水量:腦組織含水量=濕重－干重/濕重×100%。

1.4 鑭醛固定液的配置 首先量取0.2mol/L二甲砷酸鈉緩沖液50ml、10%多聚甲醛水溶液20ml、25%戊二醛原液8ml和適量雙蒸水溶解的硝酸鑭(2g)溶液，最后雙蒸水加至100ml，并緩慢加入0.1mol/L NaOH 并把 pH 調(diào)至7.4 ～7.8。

1.5 電鏡標(biāo)本制作 25℃室溫條件下，在各時(shí)間段仰臥位固定大鼠，迅速打開(kāi)胸腔，露出心臟，用灌注針頭從左心插入主動(dòng)脈弓，剪開(kāi)右心房，先用等滲生理鹽水沖洗，直至大鼠的血液沖洗干凈，隨后以鑭醛固定液行心臟灌注)固定，15min后開(kāi)顱，在損傷灶周圍4mm內(nèi)取2～3塊腦組織，所取腦組織應(yīng)大小應(yīng)小于1mm×1mm×lmm，把標(biāo)本置鑭醛固定液中并放入4℃冰箱8h，用含1%硝酸鑭的二甲砷酸鈉緩沖液洗滌2次，每次15min，立即用含1%硝酸鑭、四氧化鋨酸溶液再浸泡腦組織固定3h，按順序分別用50% 乙醇浸泡15min×1次;用70% 乙醇浸泡15min×1次;用90% 乙醇浸泡15min×1次;用100%乙醇浸泡15min×3次;用純環(huán)氧丙烷浸泡15min×2次;用環(huán)氧丙烷+環(huán)氧樹脂包埋劑1∶1包埋后置于37℃烤箱中1h，再拿出置于純環(huán)氧樹脂中放于37℃ 烤箱中4h。再置入塑料膠囊包埋，放進(jìn)60℃烤箱中48h，用5型超薄切片機(jī)，切60～90nm厚的薄片，置于150個(gè)網(wǎng)目的銅網(wǎng)上用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，最后在日立H-600型透射電鏡觀察并攝片。

1.6 BBB通透性的結(jié)果判斷 鑭通透性按等級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn):BBB外未見(jiàn)硝酸鑭(+);BBB外有少量硝酸鑭();BBB外有中等量硝酸鑭();BBB外有大量硝酸鑭()。

2 結(jié)果

2.1 硝酸鑭示宗法 (1)常溫對(duì)照組:在第1天、第3天、第5天、第7天中，La3+都附著在血管腔內(nèi)壁，血管外沒(méi)有鑭顆粒滲出，緊密連接無(wú)開(kāi)放，內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)腫脹、壞死，毛細(xì)血管腔內(nèi)膜完整、連續(xù)、光滑、層次清楚(見(jiàn)圖1)。(2)冷環(huán)境對(duì)照組:與常溫對(duì)照組基本相同。(3)傷后冷環(huán)境組:第1天:血管內(nèi)可見(jiàn)鑭顆粒，并可見(jiàn)大量鑭顆粒滲出到血管外神經(jīng)組織及組織間隙中，內(nèi)皮細(xì)胞中也可見(jiàn)鑭顆粒，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，吞飲小泡增多。第3天:可見(jiàn)高密度的鑭顆粒通過(guò)增寬的緊密連接間隙，通過(guò)基底膜到達(dá)細(xì)胞外間隙(見(jiàn)圖2)。第5天:鑭顆粒滲透到血管外周圍，與第1天和第3天比較，血管腔內(nèi)見(jiàn)鑭顆粒滲出明顯減少(見(jiàn)圖3)。第7天:仍有少量鑭顆粒通過(guò)基底膜到細(xì)胞外間隙，但比第5天明顯少。(4)傷后常溫組:各時(shí)間段鑭顆粒滲出情況基本與常溫致傷組相同，都是第1天、第3天滲出達(dá)高峰，第5天、第7天持續(xù)逐漸減少，但各時(shí)間段滲出的量都比傷后冷環(huán)境組少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)(見(jiàn)圖4、見(jiàn)圖5)分別為第3天、第5天。(5)大鼠腦損傷后血管緊密連接的變化:鑭顆粒成直線通過(guò)血管壁，血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接呈開(kāi)放狀態(tài)(見(jiàn)圖6)。

2.2 腦組織含水量變化 傷后常溫組致傷后在第1天時(shí)腦組織含水量明顯高于常溫對(duì)照組，腦含水量增高持續(xù)至第3天，而第1天、第3天、第5天與同時(shí)段的常溫對(duì)照組比較均存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，傷后第7天仍然高于同時(shí)段的常溫對(duì)照組，但與同時(shí)段的常溫對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。傷后冷環(huán)境組在第1天時(shí)腦組織含水量明顯高于冷環(huán)境對(duì)照組，傷后第5天開(kāi)始下降，第1天、第3天、第5天與同時(shí)段的冷環(huán)境對(duì)照組比較均存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，第7天仍然高于同時(shí)段的冷環(huán)境對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。傷后冷環(huán)境組第1天腦組織含水量高于傷后常溫組，直至增高到第3天，傷后第5天開(kāi)始下降，第1天、第3天、第5天與同時(shí)段的傷后常溫組比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，第7天仍然高于同時(shí)段的傷后常溫組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。低溫對(duì)照組與常溫對(duì)照組各亞組同時(shí)段相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 各組不同時(shí)間段腦組織含水量(%±s)

表1 各組不同時(shí)間段腦組織含水量(%±s)

與冷環(huán)境對(duì)照組比較#P＜0.05;常溫對(duì)照組比較*P＜0.05;冷環(huán)境對(duì)照組比較＆P＜0.05;傷后常溫組比較△P＜0.05

組別 第1天(n=5) 第3天(n=5) 第5天(n=5) 第7天(n=5)常溫對(duì)照組冷環(huán)境對(duì)照組傷后常溫組傷后冷環(huán)境組77.95 ±0.1577.95 ±0.4481.96 ±0.03*＆82.04 ±0.44#△77.97 ±0.1277.97 ±0.0681.96 ±0.04*＆82.05 ±0.05#△77.98 ±0.0877.97 ±0.0779.77 ±0.39*＆80.55 ±0.35#△77.97 ±0.0977.98 ±0.0678.12 ±0.2078.18 ±0.29

3 討論

血腦屏障(blood brain barrier，BBB)是介于血液和腦組織之間低通透性且具有一定選擇性的動(dòng)態(tài)界面，半徑大于1nm的親水分子僅少量可被動(dòng)地通過(guò)此屏障，故此屏障是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制，對(duì)穩(wěn)定腦組織內(nèi)環(huán)境有重要意義。BBB是一個(gè)非常復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，它主要由3層結(jié)構(gòu)組成:(1)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)層［各EC以緊密連接(TJ)連接］;(2)血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞;(3)以及基膜(BM)等結(jié)構(gòu)構(gòu)成，而腦組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞間的緊密連接構(gòu)成的細(xì)胞層是BBB的基礎(chǔ)，顱腦損傷后血腦屏障的破壞損傷了血流和腦物質(zhì)交換的血管內(nèi)皮細(xì)胞層，導(dǎo)致血管中的血漿蛋白和水溶性物質(zhì)滲透到腦組織中而使腦腫脹、顱內(nèi)壓增高和血管壓迫性局部缺血等方面促進(jìn)腦組織進(jìn)一步損害［3］。

近些年來(lái)的研究表明顱腦損傷后BBB通透性的變化與多種機(jī)制有關(guān)。鄭躍英［4］等認(rèn)為腦損傷血腦屏障通透性增加可能與水通道蛋4有關(guān);王洪生［5］等認(rèn)為大鼠腦挫傷后BBB的開(kāi)放與血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連的中斷有關(guān);Castillo［6］等認(rèn)為基底膜中Ⅳ型膠原、層黏連蛋白和纖黏連蛋白等物質(zhì)的水解導(dǎo)致血腦屏障的破壞，從而使腦水腫加重。本研究中發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組中鑭顆粒未滲透到血管壁外，說(shuō)明其腦組織沒(méi)有受到影響，而大鼠顱腦損傷后在各時(shí)間點(diǎn)都看到鑭顆粒通過(guò)血管進(jìn)入到神經(jīng)組織中，并可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接間距增加，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)腦損傷后血腦屏障通透性增加與血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接開(kāi)放有關(guān)。

直接暴露于冷環(huán)境下對(duì)機(jī)體有一定的影響，以往針對(duì)冷環(huán)境對(duì)機(jī)體影響的研究有心血管系統(tǒng)、機(jī)體代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等。Westfall等［7］將大鼠置于4℃冷環(huán)境7d，發(fā)現(xiàn)慢性冷刺激能夠提高交感神經(jīng)緊張度，而較長(zhǎng)時(shí)間處于寒冷環(huán)境中，機(jī)體運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)的功能都會(huì)受到抑制。Feng等［8］用冰水刺激大鼠不但引起腦內(nèi)快速的早期可逆性Tau蛋白磷酸化也導(dǎo)致刺激時(shí)間依賴性的遲發(fā)型Tau蛋白磷酸化，說(shuō)明冷環(huán)境可能是神經(jīng)變性疾病的一個(gè)危險(xiǎn)誘導(dǎo)因素。代大偉［9］等認(rèn)為33℃ ±0.5℃局部腦溫度既通過(guò)減輕BBB完整性的破壞在轉(zhuǎn)錄水平抑制AQP-4 mRNA表達(dá)的增加，也可以在翻譯水平直接抑制了AQP-4蛋白質(zhì)的表達(dá)，減輕腦出血后的腦水腫形成。Masahiko［10］等在大鼠腦出血后給予5℃冷環(huán)境，發(fā)現(xiàn)5℃冷環(huán)境能減少腦出血后血腦屏障損害和炎癥反應(yīng)。有研究報(bào)道長(zhǎng)時(shí)間寒冷暴露對(duì)正常神經(jīng)系統(tǒng)的功能產(chǎn)生影響，因此，闡明在大鼠腦損傷后暴露于4℃冷環(huán)境下BBB通透性變化的機(jī)制具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

本研究通過(guò)建立大鼠腦損傷后冷環(huán)境下的動(dòng)物模型，用硝酸鑭示蹤法來(lái)驗(yàn)證血腦屏障通透性。正常情況下鑭顆粒是不能通過(guò)BBB的，只有當(dāng)BBB破壞后鑭顆粒才能通過(guò)受損的BBB滲透到血管外。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常溫對(duì)照組和低溫對(duì)照組的血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)損傷，鑭顆粒沒(méi)有滲透到血管外，而傷后常溫組和傷后冷環(huán)境組在第1天、第3天、第5天、第7天中都可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞層緊密連接開(kāi)放，鑭顆粒滲透到血管外，且第1天、第3天滲出最多;第5天、第7天逐漸減少，可提示傷后腦通透性改變?cè)诔嘏c冷環(huán)境的高峰期是在第1天、第3天。傷后冷環(huán)境組滲出的鑭顆粒在各時(shí)間點(diǎn)比傷后常溫組多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，血管內(nèi)皮緊密連接開(kāi)放增加，從而促進(jìn)BBB破壞，進(jìn)一步加重腦水腫。本次試驗(yàn)也證實(shí)了傷后常溫組腦含水量與傷后冷環(huán)境組比明顯較少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，因此大鼠腦損傷后暴露于4℃冷環(huán)境下可促進(jìn)緊密連接的開(kāi)放，增加血腦屏障通透性，進(jìn)而加重腦水腫，但暴露于冷環(huán)境下如何促進(jìn)血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接開(kāi)放的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖1 常溫對(duì)照組和冷環(huán)境對(duì)照組:鑭顆粒聚集在血管腔內(nèi)

圖2 傷后冷環(huán)境組(第3天):大量的鑭滲透到組織間隙中

圖4 傷后常溫組(第3天):血管外神經(jīng)組織中可見(jiàn)鑭顆粒與(圖2)比，鑭顆粒顯著較少

圖5 傷后常溫組(第5天):血管外周可見(jiàn)少量鑭顆粒與(圖3)比較，鑭顆粒滲出減少

圖6 大鼠腦損傷后血管緊密連接的變化:鑭顆粒以直線通過(guò)血少管壁，血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接呈開(kāi)放狀態(tài)

［1］ Lieberman HR，Bathalon GP，F(xiàn)alco CM.Severe decrements in cognition function and mood induced by sleep loss，heat，dehydration，and undernutrition during cognition function and mood induced by sleep loss，heat，dehydration，and undernutrition during simulated combat［J］.Biol Psychiatry，2005，57(4):422 －429.

［2］ Feeny DM，Boyeson MG，Linn RT，et al.Responses to cortical injury:I.Methodology and local effects of contusions in the rat［J］.Brain Res，1981，211(1):67 －77.

［3］ Siesjo BK，Siesjo P.Mechanisms of secondary brain injury［J］.Eur J Anaesthesiol，1996，13:247 －268.

［4］ 鄭躍英，蘭允平，祝勝美.大鼠腦缺血/再灌注損傷后梗死灶周圍水通道蛋白4與血腦屏障通透性的動(dòng)態(tài)變化［J］.中國(guó)病理生理雜志，2008，24(8):1647 －1655.

［5］ 王洪生，趙佩林，孫曉峰.大鼠急性局灶性腦挫裂傷后血腦屏障的改變研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(2):149 －152.

［6］ Castillo J，Leira R，Blanco M.Metalloproteinases and neurovascular injury［J］.Neurologia，2004，19:312 －320.

［7］ Westfall TC，Yang CL，Chen X，et al.A novel mechanism prevents the development of hypertension during chronic cold stress［J］.Auton Autacoid Pharmacol，2005，25(4):171 －177.

［8］ Feng Q，Cheng B，Yang R，el al.Dynamic changes of phosphorylated tau in mouse hippocampus after cold water stress［J］.Neurosci Lett，2005，388(1):13 －16.

［9］ 代大偉，王德生，李克深，等.局部亞低溫對(duì)大鼠腦出血后水通道蛋白4表達(dá)的影響［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86(13):906－910.

［10］ Kawanishi M，Kawai N，Nakamura T，et al.Effect of Delayed Mild Brain Hypothermia on Edema Formation After Intracerebral Hemorrhage in Rats［J］.JStroke Cerebrovasc Dis，2008，17(4):187 －195.