畢振威 ，王永山，范紅結(jié)

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

犬瘟熱（canine distemper, CD）是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus, CDV）感染犬、貂、浣熊和狐等食肉動(dòng)物引起發(fā)病的一種致死性傳染病。CDV弱毒疫苗的使用曾有效地防控了此病，但在過去的20年，犬瘟熱疫情重新爆發(fā)和大規(guī)模流行，而且已跨越物種限制，感染海豹、海獅等水生動(dòng)物和靈長類動(dòng)物[1]。2008年中國大陸出現(xiàn)了人工飼養(yǎng)恒河猴感染并死于犬瘟熱的病例[2]。

CDV屬于副粘病毒科麻疹病毒屬，病毒顆粒主要由核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, N)、融合蛋白(fusion protein, F)、血凝或附著蛋白(heamagg lutinin protein, H)、基質(zhì)膜蛋白(matrix protein, M)、大蛋白(large protein, L)和磷蛋白(phosphoprotein, P)構(gòu)成[3]。N蛋白是具有免疫原性的主要結(jié)構(gòu)蛋白，病毒感染早期，即可強(qiáng)烈刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的特異性抗體[4]。在動(dòng)物免疫功能低下，H蛋白和F蛋白的特異性抗體低于檢測水平時(shí)，N蛋白的特異性抗體仍能被檢測到[5]。因此，進(jìn)行CDV血清學(xué)診斷時(shí)，尤其在CDV早期感染階段，與病毒其它結(jié)構(gòu)蛋白相比N蛋白是免疫學(xué)檢測中理想的靶抗原。

CDV只有一個(gè)血清型，但存在CDV毒株之間因基因突變導(dǎo)致的抗原性差異[6-10]。本實(shí)驗(yàn)前期對引起免疫犬非典型臨床癥狀的CDV NJ01的N基因進(jìn)行了序列分析，并在大腸桿菌中表達(dá)[10]。由于犬血清中自然存在著大腸桿菌抗體，因此，用大腸桿菌表達(dá)的重組N蛋白用于CDV抗體ELISA檢測時(shí)，需要進(jìn)行嚴(yán)格的純化，其推廣應(yīng)用有較大的局限性。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)選用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將CDV NJ01的N基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，探索該重組N蛋白抗原在CDV抗體檢測中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、菌種和病毒含有6×His標(biāo)簽的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)供體質(zhì)粒pFastBacHTA、含有Bacmid和Helper plasmid的E.coliDH10Bac以及Sf9昆蟲細(xì)胞均購自Invitrogen公司；pMD18-T simple Vector購自TaKaRa公司；E.coliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；CDV NJ01毒株系由本實(shí)驗(yàn)室從表現(xiàn)為非典型犬瘟熱臨床癥狀病犬的肺與肝臟組織中分離鑒定，能在vero細(xì)胞上穩(wěn)定增殖和傳代[10]。

1.2 主要試劑MiniBEST質(zhì)粒純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、X-gal、IPTG均購自TaKaRa公司；BAC/PAC DNA分離試劑盒購自O(shè)mega公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；胎牛血清、Grace’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司；Ni-NTA His-Bind Resin親和層析柱購自Novagen公司；兔抗犬IgG抗體和HRP標(biāo)記的兔抗犬IgG抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備；犬CDV陽性血清由犬瘟熱、腺病毒2型、細(xì)小病毒病、副流感四聯(lián)活疫苗-犬冠狀病毒病滅活疫苗（美國富道動(dòng)物保健公司產(chǎn)品）5次免疫犬獲得；5份CDV疫苗免疫犬血清和3份犬CDV陰性血清由公安部南京警犬研究所惠贈；5份臨床感染CDV犬血清取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博研寵物醫(yī)院。

1.3 N基因的RT-PCR擴(kuò)增和克隆根據(jù)GenBank已發(fā)表CDV的N基因編碼區(qū)和供體質(zhì)粒pFastBacHTA閱讀框的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，分別在上游引物和下游引物加入EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)，6×His標(biāo)簽位于重組N蛋白的N端。上游引物F：5′-CCGGAATTCATGGCTAGCCTTC TCAAGAGCCTC-3′（下劃線為EcoR I位點(diǎn)）；下游引物R：5′-CCCAAGCTTTTAATTGAGTAG CTCTCTATC-3′（下劃線為HindIII位點(diǎn)）。

重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒鑒定引物：M13F（17）：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′；M13R（17）：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′。以上引物由Invitrogen公司合成。

將CDV接種vero細(xì)胞，病變后反復(fù)凍融3次取 裂 解 液， 按 TRIZOL?Reagent (InvitrogenTMLife technologies)試劑使用方法提取RNA。用RT-PCR方法擴(kuò)增CDV的N基因?；厥誑基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將其與pMD18-T simple Vector連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。用1.5%瓊脂LB平板（含氨芐青霉素100 mg/L）進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑白色單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR I和Hind III雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得陽性克隆質(zhì)粒pMD-N，測序由Invitrogen公司完成。

1.4 N基因重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建將pMD-N和pFastBacHTA分別用EcoRI與HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后分別回收N基因和載體片段，DNA凝膠回收試劑盒純化，T4DNA 連接酶連接并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，用1.5%瓊脂LB平板（含氨芐青霉素100 mg/L）篩選轉(zhuǎn)化菌，挑單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，用MiniBEST質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒，EcoR I與Hind III雙酶切鑒定，獲得重組供體質(zhì)粒pFastBac-N。

1.5 N基因重組Bacmid DNA的獲得用重組供體質(zhì)粒pFastBac-N轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH10Bac，在LB培養(yǎng)基中37℃、220 r/min振搖4 h，涂布在LB瓊脂平板（含有卡那霉素50 mg/L、慶大霉素7 mg/L、四環(huán)素10 mg/L以及X-gal 100 mg/L和IPTG 40 mg/L），37℃培養(yǎng)24 h。挑白色單菌落接種于含有上述三種抗生素的LB中，37℃振搖培養(yǎng)24 h，用BAC/PAC DNA 分離試劑盒提取重組Bacmid DNA。同步提取E.coliDH10Bac中的Bacmid DNA作為空白對照。分別用N基因上游引物F和M13R（17）以及M13F（17）和M13R（17）兩種引物組合，PCR鑒定重組Bacmid DNA，獲得含N基因的重組Bacmid DNA，命名為rBacmid-N。

1.6 N基因重組桿狀病毒的獲得在轉(zhuǎn)染前1 d，用對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細(xì)胞在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中制備單層細(xì)胞。將rBacmid-N按Lipofectamine2000使用說明書轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)棄去舊培養(yǎng)液，用無血清無抗生素的Grace’s液洗滌細(xì)胞。然后用孵育好的rBacmid-N和Lipofectamine2000混合物轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞單層，在27℃作用5 h后棄去轉(zhuǎn)染混合物，每孔加入含10%血清及抗生素的Grace’s完全培養(yǎng)液，置27℃繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察病變，直到細(xì)胞病變達(dá)90%時(shí)，收集細(xì)胞及上清液，在Sf9昆蟲細(xì)胞上繼續(xù)傳代2次后進(jìn)行鑒定，獲得第3代（P3代）重組桿狀病毒vBacmid-N。同步用未插入外源基因的Bacmid質(zhì)粒和單用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞作為對照。

1.7 Western blot分析將P3代vBacmid-N感染的Sf9細(xì)胞、Bacmid轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的野生桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞和正常的Sf9細(xì)胞用0.01 mol/L PBS（pH7.2）離心洗滌2次后，用PBS重懸加入5×SDS-Loading Buffer，按常規(guī)方法進(jìn)行SDSPAGE電泳分析，并將其轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（NC膜）上，用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，洗滌后加犬CDV高免血清室溫作用1 h，然后在洗滌的NC膜中加入HRP標(biāo)記的兔抗犬IgG抗體，作用1 h后洗滌，DAB底物顯色。

1.8 間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunof l uorescent assay, IFA） 檢測實(shí)驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。將P3代重組桿狀病毒vBacmid-N接種到Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后用0.01 mol/L PBS（pH7.2）洗滌2次；加入－20℃預(yù)冷的無水乙醇（1 mL/孔），4℃固定30 min，用PBS洗滌3次，拍干；加入100倍稀釋的犬抗CDV高免血清（200 μL/孔），37℃孵育1 h，PBS洗滌5次，拍干；加入兔抗犬IgG抗體（200 μL/孔），37℃孵育1 h，PBS洗滌5次，拍干；加入50倍稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體工作液（200 μL/孔），37℃孵育1 h，PBS洗滌5次，置于熒光顯微鏡下觀察。同步設(shè)立野生桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞和正常Sf9細(xì)胞為對照。

1.9 間接 ELISA按 Ni-NTA His-Bind Resin 親和層析柱使用說明純化N蛋白。以純化的重組N蛋白為包被抗原，采用方陣試驗(yàn)方法優(yōu)化抗原包被濃度、被檢血清稀釋和HRP標(biāo)記的兔抗犬IgG，建立CDV抗體間接ELISA檢測方法。對5份CDV疫苗免疫犬血清、5份臨床感染CDV犬血清和3份犬CDV陰性血清進(jìn)行檢測，重復(fù)3次，檢驗(yàn)重組N蛋白的特異性與穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 N基因的擴(kuò)增與克隆從感染CDV的vero細(xì)胞凍融物中提取RNA，RT-PCR方法擴(kuò)增出約1600 bp的片段，與CDV的N基因理論值（1572 bp）相符。將N基因與pMD18-T simple Vector連接構(gòu)建成重組克隆質(zhì)粒pMD-N，用EcoRI與HindIII雙酶切，可得到約1600 bp的N基因片段和3000 bp的克隆載體片段（圖1）。測序結(jié)果(已錄入GeneBank中，序列號為JF965338)在GenBank中比對分析，顯示為CDV的N基因。

2.2 N基因重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建將N基因與pFastBacHTA載體片段連接，獲得含N基因的重組供體質(zhì)粒pFastBac-N，經(jīng)EcoRI和Hind III雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳可見2條長度分別約1600 bp和5000 bp的條帶，與N基因和pFastBacHTA片段的理論值相符合（圖1）。

圖1 CDV N基因重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pMD-N and pFastBac-N

2.3 N基因重組Bacmid DNA的獲得用pFastBac-N轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑和三種抗性篩選，挑白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取含N基因的重組Bacmid DNA。分別用N基因F、M13R（17）引物組合和M13F（17）、M13R（17）引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，得到了2189 bp和3959 bp的預(yù)期大小片段。對照質(zhì)粒Bacmid由于缺少目的基因，無法與N基因F特異結(jié)合而無條帶出現(xiàn)，而用M13F（17）和M13R（17）只擴(kuò)增出307bp的片段（圖2)，表明成功獲得含N基因的重組Bacmid DNA（簡稱：rBacmid-N）。

2.4 N基因重組桿狀病毒的獲得將鑒定好的rBacmid-N用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，5 d后轉(zhuǎn)染孔可見部分細(xì)胞變圓變大，d6細(xì)胞病變達(dá)90%以上。收集病變細(xì)胞及上清，1500 r/min離心10 min，上清液即為含N基因的重組桿狀病毒vBacmid-N原液（P1代），繼續(xù)傳代2次，獲得高效價(jià)的P3代重組桿狀病毒。

圖2 CDV N 基因重組Bacmid DNA（rBacmid-N）的PCR鑒定Fig.2 Analysis of recombinant Bacmid DNA (rBacmid-N)by PCR

2.5 Western blot分析對P3代vBacmid-N感染的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行SDS-PAGE，用Western blot分析，在62 kDa處可見一條特異蛋白帶，與重組N蛋白的理論值相符合，表明重組N蛋白在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，并具有CDV抗原反應(yīng)性。正常Sf9細(xì)胞和野生桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞均無特異的蛋白帶（圖3）。

2.6 IFA檢測在IFA試驗(yàn)中，vBacmid-N感染的Sf9細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光，而正常Sf9細(xì)胞和Baculovirus感染的sf9細(xì)胞均沒有熒光（圖4）。

2.7 間接ELISA將純化的重組N蛋白進(jìn)行SDSPAGE，用凝膠圖像分析軟件BandScan5.0分析，純度達(dá)80%（圖3）。以純化的重組N蛋白為包被抗原，采用方陣試驗(yàn)方法確定的抗原包被濃度為1 mg /L，被檢血清的稀釋度為1:200。檢測5份CDV疫苗免疫犬血清和5份臨床感染CDV犬血清檢測，其A450值均大于0.4，其中有6份高于0.8；而3份犬CDV陰性血清的A450值均小于0.05，顯示出了良好的抗原特異性和穩(wěn)定性。

圖3 vBacmid-N感染Sf 9細(xì)胞SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果Fig.3 Analysis of vBacmid-N infected sf9 cells by SDS-PAGE and Western blot

圖4 vBacmid-N感染的Sf9昆蟲細(xì)胞IFA檢測結(jié)果Fig.4 IFA detection result of Sf9 cells infected with vBacmid-N by IFA

3 討論

目前，免疫接種是防控CD的有效方法，但免疫效果并非總是有效，世界許多國家均有免疫犬爆發(fā)CD疫情或發(fā)病的報(bào)道[11]，其臨床癥狀也呈現(xiàn)多樣化。我們曾在臨床病例中發(fā)現(xiàn)了免疫犬感染CDV，表現(xiàn)為CD的非典型臨床癥狀。盡管免疫失敗與疫苗質(zhì)量、母源抗體干擾、動(dòng)物免疫狀態(tài)和應(yīng)激等因素相關(guān)，但是CDV毒株基因變異導(dǎo)致其抗原性和致病性與疫苗株存在差異可能也是一個(gè)重要因素[6]。CDV的N蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，又是免疫原性較強(qiáng)的蛋白，許多CDV分離毒株的N基因發(fā)生變異已被證實(shí)[9-13]。本實(shí)驗(yàn)室對引起免疫犬表現(xiàn)非典型CD臨床癥狀的CDV NJ01病毒N基因進(jìn)行了序列分析，該非典型CDV具有強(qiáng)毒株的分子特征[10]。

ELISA方法是檢測CDV血清抗體的一種快速、敏感和特異方法，傳統(tǒng)的CDV抗體ELISA檢測方法，通常用全病毒作為包被抗原，但CDV在Vero細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒滴度較低，并且需要采用超速離心等復(fù)雜的純化技術(shù)，而且病毒蛋白不穩(wěn)定[14]，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。姜騫等[15]和Latha等[16]原核表達(dá)N蛋白，建立間接ELSIA血清學(xué)診斷方法。Messling[14]等利用桿狀病毒重組表達(dá)的CDV野生分離株(2544/Han95)的N蛋白建立捕獲夾心ELISA，用于檢測犬血清中的IgM和IgG。

為了制備便于檢測試劑標(biāo)準(zhǔn)化的非典型CDV抗體檢測抗原，本實(shí)驗(yàn)室曾將非典型CDV NJ01的N基因在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)，由于表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在，重組N蛋白的純化與復(fù)性比較繁瑣。此外，用大腸桿菌表達(dá)的蛋白作抗原檢測動(dòng)物體內(nèi)的抗體，常因純化的抗原中存在大腸桿菌成份污染而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性。桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有與高等細(xì)胞類似的翻譯后修飾系統(tǒng)，其表達(dá)外源蛋白的生物學(xué)活性與天然產(chǎn)物極其相似，能夠保持較好的抗原性和免疫原性[17]。自然狀態(tài)下，犬體內(nèi)不存在昆蟲細(xì)胞抗體，因此，本研究選用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)N蛋白作為CDV抗體檢測抗原，以期改善檢測方法的特異性與穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)的重組N蛋白，經(jīng)Western blot、IFA和間接ELSIA三種方法分析，均顯示了良好的抗原特異性，用該重組蛋白作為抗原建立的CDV血清抗體間接ELISA方法具有良好的特異性和穩(wěn)定性，優(yōu)于大腸桿菌表達(dá)的重組N蛋白。此外，用分離株CDV NJ01的N基因表達(dá)產(chǎn)物作為抗原，可能更適于本地區(qū)CDV血清抗體的檢測。該抗體檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化工作也在進(jìn)行之中。

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