萬春和，黃 瑜，程龍飛, 傅光華, 施少華, 陳紅梅

（福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013)

圓環(huán)病毒科（Circoviridae）包括2個屬：圓圈病毒屬（Gyrovirus）和圓環(huán)病毒屬（Circovirus）。圓圈病毒屬只有雞貧血病毒（Chicken infectious anemia virus, CIAV）一個成員；而圓環(huán)病毒屬目前有包括豬圓環(huán)病毒（Porcine circoviruses, PCV1 、PCV2）I型和II 型、鸚鵡喙羽病毒（Psittacine beak and feather disease virus, BFDV）[1]、鴿圓環(huán)病毒（Pigeon circovirus, PiCV）[2]、鵝圓環(huán)病毒（Goose circovirus,GoCV）[3]、鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus, DuCV）[4]、金絲雀圓環(huán)病毒(Canary circovirus,CaCV)[5]、渡鴉圓環(huán)病毒(Raven circovirus, RaCV)[6]、八哥圓環(huán)病毒（Starling circovirus，StCV）[7]、雀圓環(huán)病毒(Finch circovirus, FiCV)、鷗圓環(huán)病毒(Gull circovirus,GuCV)[8]和天鵝圓環(huán)病毒(Mute swans (Cygnus olor)circovirus, SwCV)[9]等。

鴿圓環(huán)病毒(GoCV)最早于1993年在美國報道[10]，此后在加拿大[11]、澳大利亞[12]、德國[2]、英國[3]、法國[13]、比利時[14]、意大利[15]和美國[16]均發(fā)現有感染報道。余旭平等[17,18]最早在中國浙江省檢測到鴿圓環(huán)病毒感染，并對浙江省鴿圓環(huán)病毒的基因組結構進行分析。本文根據GenBank登錄已發(fā)表的PiCV序列設計引物，對來自福建省某信鴿養(yǎng)殖廠送檢病料進行PiCV檢測，通過反向PCR技術獲得全長基因序列，并進行生物信息學分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑蛋白酶K（Proteinase K）和十二烷基硫酸鈉（SDS） 購自Sigma公司；DreamTaq Green PCR Master Mix購自Fermentas公司；DNA Marker（DL2000）和pMD18-T載體均購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒、質粒純化試劑盒均購自Omega；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞自制。

1.2 病料處理及核酸提取參考文獻[19]，實驗病料為來自福建省某信鴿場，采集送檢信鴿肝臟和脾臟。將組織以無菌PBS（pH 7.4）1: 5按常規(guī)方法勻漿后，反復凍融3次。提取鴿圓環(huán)病毒基因組DNA步驟：取1 mL組織勻漿液于室溫10 000×g離心5 min，取540μL上清，加入60μL 10% SDS于37℃水浴作用30 min，加入15μL蛋白酶K（20 mg/mL），混勻后于56℃水浴作用2 h，間或搖勻。取出后分別置于95℃ 和-20℃各5 min后，加入等體積Tris飽和酚，混勻后靜置15 min后，4℃ 12 000×g離心10 min。取離心上清再次加入等體積Tris飽和酚，重復離心。取離心上清加入1/10（上清體積）pH 5.2 醋酸鈉溶液和1/10（上清體積）異丙醇，混勻后置于-20℃過夜后，4℃ 12 000×g離心10 min，棄上清，揮發(fā)片刻后加入30 μL滅菌去離子水重懸，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 鴿圓環(huán)病毒基因的PCR擴增參考文獻[16]設計引物，擴增的目的片段大小約為759 nt。引物序列 為 P1F：5'-GATGACTTCTACGGCTGGCTGCC-3'、P1R: 5'-ACGGCAAACCAGTCGGCAGCAACC-3'。PCR采用50μL體系：DreamTaq Green PCR Master Mix 25μL、上下游引物（引物濃度為20 mmol/L）各 1μL、DNA 模板 1μL、加雙蒸水至終體積為50μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min，隨后進行94 ℃變性50 s、53 ℃退火35 s、72℃延伸1 min循環(huán)，35個循環(huán)后，72℃延伸10 min。反應結束后，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。將PCR產物目的片段經膠回收試劑盒純化后與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，用雙酶切和PCR方法鑒定重組質粒，隨機選取3個陽性重組質粒送由上海生工生物工程有限公司進行序列測定。

1.4 病毒全基因組的測定根據1.3中的測序結果，參考GenBank中鴿圓環(huán)病毒登錄的序列設計一對反向引物（invers-primer）用于擴增病毒基因組余下的基因片段P2F：5'-TCACTTCACATTCATAATACAT-3'、P2R: 5'-TGCTGGTCACTATTATCACGC-3'。擴增片段大小約1560 nt，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應條件為：94℃預變性5 min，隨后進行94℃變性 50 s、52℃退火35 s、72℃延伸 100 s，35個循環(huán)后，72℃延伸10 min。反應結束后，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。將PCR產物目的片段經膠回收試劑盒純化后與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，用雙酶切和PCR方法鑒定重組質粒，隨機選取3個陽性重組質粒送上海生工生物工程有限公司進行序列測定。

1.5 全基因序列分析將測序結果與GenBank中登錄的序列進行分析，用Lasergene v 7.1 DNAStar軟件進行序列整理和校對，將拼接后的核苷酸序列，分別與GenBank中登錄的鴿圓環(huán)病毒（GenBank登錄號見表1）進行同源性比較，用MEGA4.1繪制遺傳進化樹[20]，以鵝圓環(huán)病毒株（GenBank登錄號GU320569）作為外支（outgroup），用Bootstrap對進化樹的可靠性進行評價，重復1000次。

2 結果

2.1 測序結果應用Lasergene v 7.1 DNAStar軟件分析序列測定結果，并進行序列拼接后獲得PiCV-fj1株病毒基因組全長2037 nt（GenBank登錄號JN183455）。分析可得，該株病毒ORF-V1(41～994nt) 編碼復制相關結構蛋白（the replicated-associated protein，Rep），ORF-C1（1987～1166nt）編碼核衣殼蛋白（the putative capsid protein，Cap）。在2個主要編碼區(qū)外，還存在有2個可能與病毒復制有關的基因間區(qū)（intergenic region）：其中位于ORF-C1和ORF-V1的5′斷之間的區(qū)域，由2個反向的重復序列構成了一個發(fā)夾結構(見圖1)，其頂部有1個保守的9堿基序列“TAGTATT①AC”（①position 1）。其在莖環(huán)結構的下游還存在有反向重復序列(CACGGAGCCACNATCGC和GCGATNGTGGCTCCGTG)，N表示堿基不完全互補；其3′端基因間區(qū)長度為171nt。

圖1 鴿圓環(huán)病毒福建株5′基因間區(qū)結構圖Fig.1 The 5'intergenic region of Pigeon circovirus fj1 strain

2.3 核苷酸同源性比較應用Lasergene v7.1DNAStar軟件（By Clustal W Method Sequence Distance），將拼接后核苷酸序列，與GenBank登錄的所有的鴿圓環(huán)病毒全基因序列進行同源性比較，結果見表1。與比利時分離株Bel936同源性最高，達93.8%；與澳大利亞分離株Dove同源性最低，僅84.5%。

2.4 遺傳進化分析以GoCV作為外支，運用MEGA4.1繪制鴿圓環(huán)病毒福建株fj1和GenBank登錄的所有鴿圓環(huán)病毒遺傳進化樹，并用Bootstrap評價進化樹的可靠性，重復1000次，結果見圖2?？梢?，鴿圓環(huán)病毒在遺傳進化上分為2個明顯的分支，以編碼核衣殼蛋白（ORF-C1，Cap蛋白）起始密碼子“ATA”和“ATG”的差異（見表1）分為ATA分支和ATG分支（fj1§為鴿圓環(huán)病毒福建株）。

3 討論

3.1 到目前為止，圓環(huán)病毒屬除PCV（PCV1和PCV2）可以在PK-15細胞中繁殖外，其余成員均尚未能細胞培養(yǎng)，大大限制了對其進行深入研究。圓環(huán)病毒為無囊膜、二十面體對稱的動物病毒，其復制需要依賴于旺盛的宿主細胞活力，增殖速度快的淋巴細胞是圓環(huán)病毒侵染的主要宿主。因此，圓環(huán)病毒感染往往導致機體免疫混亂、免疫力下降，進而引起多種條件性病原的二次感染，鴿感染圓環(huán)病毒后可表現為昏睡、食欲降低、體重減輕等癥狀[10-16,18,21]。本研究中福建某地送檢的信鴿檢測到PiCV感染，由于PiCV既可通過糞便等污染物水平傳播，又可經鴿胚垂直傳播[22]，提示我們在信鴿引育種環(huán)節(jié)應注意相關感染的監(jiān)測。

3.2 本實驗株fj1基因組全長為2037 nt，與比利時分離株Bel936同源性最高，達93.8%；與澳大利亞分離株Dove同源性最低，僅84.5%，和余旭平報道的稍有差異。經分析fj1基因組編碼2個主要ORF(見表1)：復制相關rep蛋白編碼的ORFV1(41～994nt)， 外 殼 蛋 白 cap 編 碼 的 ORF-C1(1987～1166 nt)。在病毒的兩個主要編碼區(qū)外還存在有2個可能與病毒復制、增殖相關的基因間區(qū)：其中位于ORF-C1和ORF-V1的5′端之間的區(qū)域，fj1株長度為90 nt，其他鴿圓環(huán)病毒5′端間區(qū)長短略有差異，主要集中在90～101 nt之間（數據未給出），由2個反向的重復序列構成了一個發(fā)夾結構，

其頂部有1個保守的9堿基序列“TAGTATT①AC”（①position 1）。其在莖環(huán)結構的下游還存在有反向重復序列(CACGGAGCCACNATCGC和GCGATNGTGGCTCCGTG) ,一般認為該病毒是通過滾環(huán)模式進行核酸復制，反向PCR擴增剩余病毒基因組片段也正是基于上述特點。其ORF-C1編碼的Cap蛋白起始密碼子有2類，除常見的“ATG”外還有“ATA”，這和其3′端基因間區(qū)長度為171 nt或170 nt有關：3′端基因間區(qū)長度為171nt，其ORF-C1起始密碼子均為“ATG”，而3′端基因間區(qū)長度為170 nt，其ORF-C1起始密碼子均為ATA（見表1）。

表1 fj1株與其它鴿圓環(huán)病毒全基因核苷酸同源性分析Table1 Homology identity analysis all of the nucleotide in the genus Pigeon circovirus

圖2 鴿圓環(huán)病毒遺傳進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Pigeon circoviruses

3.3 對GenBank中登錄的所有鴿圓環(huán)病毒全基因序列進行遺傳進化分析（圖2），可見鴿圓環(huán)病毒在遺傳進化上分為兩個明顯的分支。結果分析表明，兩個獨立遺傳進化分支與編碼核衣殼蛋白（ORF-C1，Cap蛋白）起始密碼子堿基（ATA和ATG）（見表1）相一致，其中Cap蛋白起始密碼子為“ATA”為一個分支，而Cap蛋白起始密碼子為“ATG”均處在另外一個分支。本實驗株和我國浙江分離株均處在“ATG”分支，但分處不同的亞群，提示我國PiCV的感染和進化可能有不同的進化來源或獨立進化的時間較長，相關遺傳進化與編碼Cap蛋白起始密碼子的關聯還需要更多更深入的研究。

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