孫淑芬,張影杰,姜新朋,張穎麗

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科,吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院手術(shù)室）

牙髓組織是一種特殊的疏松結(jié)締組織,當(dāng)受到刺激時(shí),會(huì)產(chǎn)生防御性炎癥反應(yīng)。近年來(lái)的研究顯示基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs）在牙髓病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,也受到學(xué)者們重視[1,5,15]。MMP-8導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM））降解,對(duì)牙髓組織的損傷存在著復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制,但目前對(duì)MMP-8在牙髓病中的作用機(jī)制尚不清楚,進(jìn)一步研究,有助于了解牙髓損傷與修復(fù)的機(jī)制,為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

三級(jí)生物安全防護(hù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室(PⅢ）,二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo,USA）,生物安全柜(Heal force,上海力申）,倒置相差顯微鏡(Olympus,Japan）,酶聯(lián)檢測(cè)儀(DO32022,華東）,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costor,USA））,濾器(PALL,USA）。Gene Amp PCR System9600擴(kuò)增儀(PERKIN-ELMER,USA）。

1.2 主要試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco,USA）,胎牛血清FBS(PAA,奧地利）,胰蛋白酶(Gibco,USA）,EDTA(Gibco,USA）,二甲基亞砜DMSO(Sigma,USA）,MTT(Sigma,USA）,Tris(Sigma,USA）,其它為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 人牙髓細(xì)胞的體外培養(yǎng)

取因正畸或阻生拔除的健康牙齒(均無(wú)齲壞、根尖周炎及牙周炎）,75%酒精消毒牙體,立即無(wú)菌條件下完整取出牙髓組織,棄根髓1/3,剪碎組織至0.5 mm3塊,以含20%FBS的 DMEM 培養(yǎng)液,37℃、5%CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中孵育。用0.25%的胰蛋白酶、0.02%EDTA的混合消化液進(jìn)行傳代,取4-7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 純化變形鏈球菌菌株培養(yǎng)及其上清液提取

將變形鏈球菌JH1140劃線接種于M-S輕唾平板培養(yǎng)基上,立即放入清潔厭氧罐中,取產(chǎn)氣袋置于厭氧罐中按說(shuō)明操作使厭氧罐內(nèi)達(dá)到厭氧環(huán)境,37℃恒溫培養(yǎng)48 h,用接種環(huán)將細(xì)菌接種于液體M-S輕唾培養(yǎng)基中,培養(yǎng)方法同上,37℃恒溫培養(yǎng)24到48 h。觀察試管中細(xì)菌生長(zhǎng)情況,約48 h后肉眼可見試管壁有淺黃色菌落附著,輕微搖晃菌落不脫落為佳。

在生長(zhǎng)良好的變形鏈球菌試管中取2 ml培養(yǎng)液,加入2.5 ml離心管中,12 000 rpm,4℃離心10 min,吸取上清液1.5 ml,0.22 μ m濾器抽濾滅菌4℃保存。

1.5 變形鏈球菌刺激牙髓細(xì)胞

取過(guò)濾獲得的變鏈上清液按1∶50比例稀釋后,加入到10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中,配置成變形鏈球菌刺激組細(xì)胞培養(yǎng)液。取生長(zhǎng)良好的牙髓細(xì)胞(細(xì)胞爬滿培養(yǎng)瓶底壁80%以上）20瓶,加入刺激組細(xì)胞培養(yǎng)液,每4 d換液一次,連續(xù)培養(yǎng)8 d后用于實(shí)驗(yàn);正常牙髓細(xì)胞作為對(duì)照。

1.6 PCR檢測(cè)變形鏈球菌對(duì)牙髓細(xì)胞MMP-8 mRNA

表1 引物設(shè)計(jì)表

采用Oligo 6.0設(shè)計(jì)引物序列,由賽百盛公司合成。反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃,2 min;以下經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)過(guò)程:變性 94℃,30 s,退火56℃,30 s,延伸72℃,60 s;再延伸 72℃,10 min,4℃保溫。取 5 μ l PCR產(chǎn)物加1 μ l 6×loading Buffer,移液器抽打混勻,在1%瓊脂糖凝膠上電泳120 V,25 min,凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取結(jié)果

牙髓細(xì)胞總RNA提取效果較好,呈清晰的28 S,18 S和5 S三條帶,其中28 S的亮度約為18 S的2倍,RNA無(wú)明顯降解、無(wú)明顯的DNA污染。

2.2 PCR產(chǎn)物

在退火溫度56℃時(shí),正常組牙髓細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄PCR,產(chǎn)物電泳無(wú)明顯條帶,MMP-8 mRNA未見表達(dá);變形鏈球菌刺激組牙髓細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄PCR后,產(chǎn)物電泳顯示在Marker標(biāo)記540 bp附近處有一清晰條帶,與預(yù)期片段大小一致。符合MMP-8引物設(shè)計(jì)片段大小,MMP-8 mRNA表達(dá)量增強(qiáng)。

3 討論

3.1 細(xì)菌對(duì)牙髓細(xì)胞合成MMPs的影響

圖1 牙髓細(xì)胞總RNA提取結(jié)果

圖2 牙髓細(xì)胞mRNA MMP-8 RT-PCR結(jié)果

牙髓炎多由口腔混合細(xì)菌的混合毒力所致,厭氧菌是感染牙髓的優(yōu)勢(shì)菌,細(xì)菌成分的增多,可刺激多種炎癥細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子,進(jìn)而促進(jìn)牙髓細(xì)胞合成MMPs增加。Chang等在研究產(chǎn)黑色素類桿菌對(duì)人牙髓細(xì)胞合成MMPs的影響時(shí),將牙齦卟啉單胞菌和牙髓卟啉單胞菌培養(yǎng)后經(jīng)離心提取其上清液加入到人牙髓細(xì)胞培養(yǎng)液中,混合培養(yǎng)8天后,凝膠酶譜分析發(fā)現(xiàn),牙髓細(xì)胞合成的MMP-2明顯增多[2]。Nakata等研究中間普氏菌,具核梭桿菌,牙髓卟啉單胞菌和牙髓卟啉單胞菌培對(duì)體外人牙髓細(xì)胞合成MMPs的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌超聲提取物可以促進(jìn)牙髓細(xì)胞合成MMP-1、MMP-2增多[3]。Tjaderhane等研究認(rèn)為細(xì)菌產(chǎn)酸可以激活MMPs[4]。由此可見,厭氧菌的侵入提高了牙髓細(xì)胞對(duì)ECM的降解活性,細(xì)菌導(dǎo)致牙髓病變可能開始于MMPs的作用。但由于早期牙髓炎細(xì)菌主要經(jīng)齲壞后變薄的牙本質(zhì)層中的牙本質(zhì)小管侵入牙髓腔,而侵入牙本質(zhì)小管中的主要菌種為致齲菌—變形鏈球菌,有研究顯示早期牙髓炎中檢測(cè)出的主要菌為變形鏈球菌[5,6]。因此本實(shí)驗(yàn)借鑒上述學(xué)者方法,采用變形鏈球菌上清液與DMEM混合培養(yǎng)液培養(yǎng)牙髓細(xì)胞,以細(xì)菌代謝產(chǎn)物快速誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)性模擬牙髓細(xì)胞損傷狀態(tài)的方法,結(jié)果顯示細(xì)菌代謝產(chǎn)物刺激牙髓細(xì)胞8d,細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變,開始出現(xiàn)散在脫壁現(xiàn)象。證實(shí)細(xì)菌成分在牙髓病發(fā)生發(fā)展中起一定作用,致病菌的定居除了通過(guò)釋放蛋白酶直接降解ECM外,還可以通過(guò)其他不同的途徑導(dǎo)致組織損傷,如MMPs途徑、纖溶酶原依賴性途徑、吞噬細(xì)胞途徑、PMN-絲氨酸蛋白酶途徑、破骨細(xì)胞吸收途徑。其中MMPs途徑是牙髓組織ECM降解的主要途徑。

3.2 牙髓細(xì)胞中MMP-8 mRNA的表達(dá)及意義

牙髓炎中MMPs的異常增多將導(dǎo)致細(xì)胞外的基質(zhì)合成與代謝失衡,使得病變發(fā)展,成惡性循環(huán),最終導(dǎo)致牙髓壞死及根尖周病變。在牙髓組織中,牙髓細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞是MMPs的主要合成細(xì)胞,其中牙髓細(xì)胞可產(chǎn)生大部分MMPs,到目前為止所發(fā)現(xiàn)的 MMPs 有:MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MT1-MMP和MMP-20[8]。蛋白溶解酶的存在是細(xì)胞外基質(zhì)降解的必備條件,這些酶根據(jù)靶分子的不同可分為三類:絲氨酸蛋白酶,半胱氨酸蛋白酶以及MMPs[9]。Creemers等研究酶在牙髓組織ECM降解中作用時(shí)發(fā)現(xiàn),膠原的降解主要依賴于MMPs,其次為半胱氨酸蛋白酶[10]。生理?xiàng)l件下,MMPs的水平較低,其與TIMPs的平衡維持著牙髓組織的健康。彈性蛋白酶、膠原酶活性的增強(qiáng)是化膿性牙髓炎以及牙髓壞死的組織化學(xué)特點(diǎn)[11]。牙髓炎中MMPs異常增多將導(dǎo)致細(xì)胞外的基質(zhì)合成與代謝平衡的打破[12、13、14],使得病變發(fā)展,呈惡性循環(huán)。ECM 是正常細(xì)胞維持生存運(yùn)動(dòng)和分化的適宜環(huán)境,它可影響細(xì)胞的形態(tài)、控制細(xì)胞的遷移、調(diào)控細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞的分化[7,15]。ECM的及時(shí)降解對(duì)于胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生組織的吸收和改建是必不可少的。正常ECM的降解將導(dǎo)致組織失去供給而壞死。MMPs及金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metal-oproteinases,TIMPs）共同調(diào)控ECM,維持細(xì)胞的穩(wěn)定性。調(diào)控機(jī)制的不平衡會(huì)使ECM過(guò)度降解導(dǎo)致一系列疾病,如腫瘤的侵入及擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、牙周炎、牙髓炎等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示體外牙髓細(xì)胞經(jīng)細(xì)菌上清液刺激8d后,正常組未見MMP-8 mRNA表達(dá),刺激組表達(dá)明顯,表達(dá)的差異說(shuō)明MMP-8是牙髓炎癥過(guò)程中重要的活動(dòng)因子之一,進(jìn)一步顯示MMP-8在牙髓炎中參與了牙髓組織ECM的降解。牙髓炎癥期,牙髓組織中ECM降解是組織發(fā)生不可逆性損傷的重要因素之一,是MMPs對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要因素,MMP-8在牙髓組織細(xì)胞外基質(zhì)代謝過(guò)程中,特別是在I型膠原的降解過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用,而I型膠原蛋白又是牙髓細(xì)胞中主要的細(xì)胞外基質(zhì)成份之一,所以對(duì)于MMP-8的研究為牙髓病的治療奠定了一定的基礎(chǔ)。基質(zhì)金屬蛋白酶在牙髓組織細(xì)胞外基質(zhì)代謝過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。因此,尋找有效的MMPs抑制劑可為攻克牙髓病開辟了一條新的途徑。

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