陳向來，唐燕華，楊崛圣

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科，南昌330006）

缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IP）是細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制的啟動(dòng)過程，1986年C.E.Murry等［1］提出缺血預(yù)處理可以減輕心肌缺血再灌注損傷、減少心律失常，但其機(jī)理仍未完全闡明。臨床上多數(shù)心臟病人在術(shù)前已有不同程度的心肌肥厚等病變，在經(jīng)歷體外循環(huán)直視手術(shù)的急性缺血后比正常心肌更容易出現(xiàn)各種心律失常。本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎肥厚心肌兔冠狀動(dòng)脈復(fù)制心肌急性缺血模型，對其中部分進(jìn)行缺血預(yù)處理，觀察其對缺血心肌的保護(hù)作用，并從縫隙連接蛋白（Cx43）角度進(jìn)一步探討心律失常的發(fā)生機(jī)制及IP對減少心律失常的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1）動(dòng)物：新西蘭大耳白兔14只，體質(zhì)量2.2～2.5kg，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2）試劑：蘇木素伊紅液（南昌大學(xué)病理教研室提供），抗Cx43多克隆抗體（博士德公司），SABC（熒光CY3）試劑盒（博士德公司，內(nèi)容：正常山羊血清5mL，生物素化二抗0.5mL，S ABC－cy3 0.5mL），PBS磷酸緩沖液，純丙酮、二甲苯、緩沖甘油、無水酒精、中性樹膠。3）設(shè)備及器材：H2S－D恒溫水溶箱（哈爾濱儀器儀表公司），BL－410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸機(jī)（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠），石蠟及冰凍切片機(jī)（英國珊頓），激光掃描共聚焦顯微鏡（包括熒光顯微鏡彩色成像輸入儀和Image－Analysis圖像分析系統(tǒng)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備

參照A.F.Cutilleta等［2］的方法建立兔左心室肥厚模型，6周后將左心室肥厚的兔參照汪謙［3］的方法建立兔肥厚心肌急性缺血模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

14只新西蘭大耳白兔均制模成功，將其按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，每組7只。1）缺血再灌組（IR組）：閉塞冠狀A(yù)前降支30min，再灌90min。2）缺血預(yù)處理組（IP組）：在缺血前預(yù)先缺血5min，再灌5min。

1.2.3 心電圖指標(biāo)的觀察和測定

以改良Curtis and Ravingerova評分方法進(jìn)行評分。1）1分：ST段抬高或QRS波增寬；2）2分：偶發(fā)室性早博 （vencreular extrasystole，VE）；3）3分：成對VE、VE二聯(lián)律三聯(lián)律或VE≥5次；4）4分：頻發(fā)VE（1min內(nèi)VE≥5次）；5）5分：室性心動(dòng)過速（ventricalar tachycanelias，VT）一陣＜30s；6）6分：VT一連≥30s；7）7分：室顫（vertrianler－fibrielation，VF）多陣?yán)塾?jì)＞30s；8）8分：VF一連＜5min；9）9分：VF多陣?yán)塾?jì)＜5min或一陣≥5min；10）10分：VF多陣?yán)塾?jì)＞5min。

1.2.4 心肌標(biāo)本的取材與保存

實(shí)驗(yàn)操作結(jié)束后，立即取動(dòng)物心臟，濾低吸干血跡，取左冠狀動(dòng)脈前降支發(fā)處約0.6cm處取前降支支配區(qū)整層心肌一塊放入液氮中保存，備冰凍切片，行免疫組化。

1.2.5 Cx43免疫組化

1）所有玻片均行防脫片處理。2）冰凍切片，片厚4μm。取一組冰凍切片，爾后將玻片放入純丙酮，室溫固定20～30min。3）固定完成后放入PBS中，3min×3次。4）洗完后，每張切片標(biāo)本用免疫組化筆畫圈以節(jié)省抗體。5）每個(gè)標(biāo)本滴加20μL 10%山羊血清，以消除非特異性抗原。6）10min后不洗，滴加1∶100單抗20μL，PBS稀釋后放入濕盒，4℃過液16～18h。7）過液后，PBS 5min×3次。8）棄去PBS液，標(biāo)本滴加1∶60生物素化二抗20μL。放入37℃電熱恒溫水浴箱30min。9）取出標(biāo)本，PBS 5min×3次。10）棄去PBS液，每個(gè)標(biāo)本加1∶120熒光素Cy3 20μL，放入37℃電熱恒溫水浴箱30min。11）取出玻片，甩去多余液體，加緩沖甘油封片，4℃保存，第2天在熒光顯微鏡下觀看。

1.2.6 圖像分析

取玻片，放在倒置熒光顯微鏡下，每張玻片各取4個(gè)視野，亮度對比度均為50，攝片。每個(gè)視野以Image－Analysis圖像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組心電圖情況比較

IR組有3例發(fā)生VT（VT一陣＜30s、VT一連≥30s、VF多陣?yán)塾?jì)＞30s各1例），有5例發(fā)生VE（其中2例為頻發(fā)VE，3例為偶發(fā)VE），1例未出現(xiàn)明顯的心律失常，但有明顯的ST段的抬高。IP組有1例發(fā)生一陣＜30sVT，之前還曾發(fā)生成對VE和頻發(fā)VE，5例發(fā)生VE（其中1例為頻發(fā)VE，4例為偶發(fā)VE），2例未出現(xiàn)明顯的心律失常，但有ST段的抬高和QRS波增寬?？傮w來說IR組發(fā)生了較多的室性心律失常，且更為嚴(yán)重，IP組VT明顯減少，VE程度減輕。用改良Curtis and Ravingerova評分方法評分，IR組評分為（4.286±1.976）分，IP組評分為（2.286±1.380）分，IP組較IR組評分顯著下降（P＜0.05）。

2.2 2組Cx43比較

IR組Cx43面積為（1 443.35±231.46）μm2，IP組Cx43面積為（1 911.72±214.77）μm2，IR 組較IP組顯著減少（P＜0.05）。

2.3 Cx43與改良Curtis and Ravingerova評分的相關(guān)關(guān)系

缺血心肌包括單純?nèi)毖徒?jīng)過預(yù)處理的缺血心肌，以Cx43面積作為因變量（x），改良Curtis and Ravingerova評分值作為結(jié)果（y），對二者進(jìn)行直線分析回歸。結(jié)果顯示，隨著心肌Cx43面積水平的升高，Curtis and Ravingerova評分值呈下降趨勢，二者存在負(fù)相關(guān)（r＝－0.683，P＝0.007）?；貧w方程為：y＝10.137－4.08×10－3x，P＝0.001。

3 討論

由心肌缺血引發(fā)的心律失常，是心外科術(shù)后常見的并發(fā)癥之一。在心外科臨床上，多數(shù)心臟病人在術(shù)前已有不同程度的心肌肥厚等病變，在經(jīng)歷體外循環(huán)直視手術(shù)的急性缺血后比正常心肌更容易出現(xiàn)各種心律失常。肥厚心肌有不同于正常心肌的供血和心電傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)，其發(fā)生室性心律失常機(jī)制尚不完全清楚。資料表明，異常心電活動(dòng)的發(fā)生與縫隙連接通道有關(guān)。作為哺乳動(dòng)物心室工作細(xì)胞最重要的縫隙連接蛋白，Cx43是目前研究的最多的一種［4］。G.E.Morley等［5］對 Cx43缺陷鼠采用光標(biāo)法測定心室的傳導(dǎo)性，Cx43缺陷鼠的細(xì)胞僅在低水平存在電耦聯(lián)，細(xì)胞間連接的傳導(dǎo)性下降了60%，僅顯示了較低水平的電耦聯(lián)。結(jié)合以往的資料，人們認(rèn)為以Cx43為主組成的低阻力通道的電耦聯(lián)使心肌細(xì)胞同步收縮，并通過離子交換發(fā)揮調(diào)控作用，以此在維持正常節(jié)律的電生理中起重要作用，而縫隙連接的結(jié)構(gòu)或功能的改變均可能引發(fā)心律失常。

關(guān)于IP抗心律失常的機(jī)制目前存在2種觀點(diǎn)。一種觀點(diǎn)認(rèn)為IP本身不具有直接抗心律失常的作用，它是通過縮小梗死面積和延緩心肌細(xì)胞壞死時(shí)間從而延緩和減輕了心律失常的發(fā)生。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)IP本身能引起心肌組織電生理特性的改變并由此發(fā)揮直接抗心律失常的作用［6］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)處理可減輕缺血再灌注室性心律失常的發(fā)生，并減輕缺血再灌注后Cx43表達(dá)的下降。本研究對Cx43面積和改良Curtis and Ravingerova評分值進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)隨著Cx43面積的增加，評分值呈下降趨勢，二者存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示Cx43在其中起積極作用。

許多研究已證明，蛋白激酶C（PKC）是IP的關(guān)鍵因素，其中的機(jī)理之一就是激活A(yù)TP敏感性鉀通道，（K＋ATP通道），促進(jìn) K＋外流，抑制Ca2＋內(nèi)流，縮短動(dòng)作電位的過程，降低心肌細(xì)胞鈣超載，從而起到保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)證明Cx43為磷酸蛋白，由此筆者推測Cx43在IP減少心律失常中的作用有如下幾方面：1）IP激活PKC，通過PKC磷酸化修飾維持Cx43的正常耦連，保證K＋ATP通道開放，促進(jìn)K＋外流，縮短了造成單向阻滯的時(shí)間窗口，起到減少折返性心律失常的作用；2）IP激活K＋ATP通道開放，促進(jìn)K＋外流，導(dǎo)致細(xì)胞外K＋升高，而低鉀是誘發(fā)觸發(fā)激動(dòng)重要原因，因此IP可能通過減輕Cx43表達(dá)的下降，減輕由于觸發(fā)激動(dòng)而引起的心律失常的發(fā)生；3）IP激活K＋ATP通道開放，可使其后缺血1～5min時(shí)靜息膜電位（RMP）迅速降低，導(dǎo)致再灌注時(shí)RMP超極化。減輕由于自律性異常而引起的缺血及再灌注心律失常的發(fā)生。

綜合而言，IP可能通過心律失常發(fā)生的各個(gè)環(huán)節(jié)減輕它的發(fā)生，K＋ATP通道開放是IP減少心律失常發(fā)生的一個(gè)中間環(huán)節(jié)，而它正是通過Cx43的正常耦連來實(shí)現(xiàn)的，因此Cx43可能是IP抗心律失常的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

［1］ Murry C E，Jennings R B，Reiner K A.Preconditioning with ischemia a delay of lethal cell in injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74（5）：1124－1136.

［2］ Cutilleta A F，Rudnik M，Iak R.Muscle and nonmuscle cell RNA polymerase activity during the development of myocardial hypertrophy［J］.J Mol Cell Cardiol，1978，10：677.

［3］ 汪謙.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：907.

［4］ Sever N I，Dupont E，Thomas N.Alterations in cardiac connexin expression in cardiom yopathies［J］.Adv Cardiol，2006，42：228－242.

［5］ Morley G E，Vaidya D，Samie F H，et al.Characterization of conduction in the ventricles of normal and heerozyrous Cx43 knockout mice using optical mapping［J］.J Cardiovasc Eleectrophysiol，1999，10：1361－1375.

［6］ Lin I，Li Y，Lin S，et al.The effect of delayed preconditioning on connex in 43in ischemic myocardium［J］.Biochem Cell Biol，2007，85（2）：175－181.