高 靜

（青島科技大學化工學院，山東 青島 266042）

0 介紹

神經(jīng)節(jié)苷脂是一類含有唾液酸的酸性鞘糖脂，是神經(jīng)細胞膜的重要組成成分，結(jié)構(gòu)中含有一種或多種成分的唾液酸，更確切的說，神經(jīng)節(jié)苷脂是由鞘氨基醇與脂肪酸相結(jié)合，然后通過酰胺鍵連接到包含一種或多種唾液酸的低聚糖鏈上［1］。在物理條件下，唾液酸分子中含有一個負電荷，通常以低聚糖，糖脂或糖蛋白的形式存在。近年來，隨著對細胞膜表面糖類生理功能研究的日益重視，神經(jīng)節(jié)苷脂的研究也日趨受到科學界的關(guān)注，特別是隨著神經(jīng)生物化學和神經(jīng)藥理學的發(fā)展，對神經(jīng)節(jié)苷脂的代謝及其生物學作用研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學的重要課題［2］。神經(jīng)節(jié)苷脂在國內(nèi)大多數(shù)依賴進口，雖然國內(nèi)外已報道了多種分離純化的方法，但大多都有操作步驟繁瑣、溶劑用量大等不足之處。目前國內(nèi)外的研究主要集中于其與生物膜其他有效成分之間的相互作用，而對神經(jīng)節(jié)苷脂的分離方法的最佳選擇未給予詳細的報道。因此，本文就多種分離純化方法做一下比較總結(jié)，對其分離過程起到一定的幫助。

1 唾液酸

唾液酸的分析從它們釋放時開始，將樣品純化后用不同技術(shù)進行分析，下面就對不同分析檢測方法做一下介紹。

1.1 樣品制備

1.1.1 唾液酸的提取方式

一般使用兩種方式處理：酸水解及固定化酶處理。

酸水解是應用最廣泛的處理方法。用恒溫箱或者加熱器將反應保持在加熱條件下（70℃～90℃）。最常用的酸是硫酸濃度為25～100mmol的酸溶液［4］。其他研究者曾經(jīng)將不同的試劑用于水解，如稀釋的鹽酸、微波處理的乙酸、次硫酸鈉或者三氟醋酸，這些都可以減少水解時間。

對于不同的酸水解都要做對照實驗（25mmol HCl，25mmol三氟醋酸TFA，25mmol H2SO4）。用鹽酸或TFA水解是最好的選擇，雖然經(jīng)過2h的水解會損失20％左右［5］，但是操作簡便。通過從微生物中獲得的神經(jīng)氨酸酶對唾液酸進行水解時損失最小，但控制生物樣品的反應并不容易，因為它的釋放依賴于組織結(jié)構(gòu)以及酶的來源情況。

酶法處理效果比水解的效果要差，因為并不能提取所有非游離唾液酸。相反，酸水解能夠提取所有非游離唾液酸，但是可能會對一部分造成破壞，并且能夠參與后面的反應過程，各有利弊。

經(jīng)過實驗比較，考慮到酶的成本及實際的反應效果，我們認為不管是采用色析法還是色度法，酸水解都是最常用的處理方法，因為這種方法重現(xiàn)性好，容易操作且成本相對較少。

1.1.2 純化

對于早前的硅酸鹽測定，陰離子交換柱是純化試樣的最常用的選擇。其他的純化方法還有固體萃取如SepPak C18柱［6］，或者對樣品進行超速離心，一般在水解后用于消除雜蛋白。另外一種可能是將陰離子交換柱與超速離心聯(lián)合應用對樣品進行處理，陰離子交換柱是最有效的提純方法，但同時也是繁瑣且耗費大的方法。因此，只有當樣品非常復雜的時候才使用這種方法。相反，SPE柱可以對樣品進行快速簡便的分離純化，但只有在干擾因素很小的條件下才適用，因此推薦在純化樣本后使用［7］。

1.2 唾液酸的測定

1.2.1 分光光度法

考慮到唾液酸的結(jié)構(gòu)與糖類似，因此將分光光度法作為測定唾液酸的專用技術(shù)。但是采用這種方法的缺點是選擇性比較差，如果沒有之前的純化步驟就不能用此法測定，而且不能用其區(qū)別不同結(jié)構(gòu)的唾液酸。測定唾液酸基本上要用到三種比色法：間苯二酚法，丙二酰硫脲測定法及酶測定法［8］。

應用最廣泛的分光光度法是由Svennerholm發(fā)明的［9］，后人對這種方法又做了一定的修正，即用陰離子交換法來提高純度。采用這種方法時在蔗糖與間苯二酚之間發(fā)生反應。由于唾液酸是糖脂類神經(jīng)節(jié)苷酯物質(zhì)所含有的特征基團，因此當與間苯二酚反應生成紫色復合物可用于神經(jīng)節(jié)苷脂的含量測定。本法主要用于人體組織和生物體液的檢測，但一些研究者已經(jīng)將其用于乳制品檢測當中，如牛奶制品和嬰兒奶粉的檢測。

1.2.2 液相色譜法

液相色譜法也是測定唾液酸較常用的方法，當樣品沒有被衍生化的時候，最常用的方法就是紫外檢測離子對的方法。這種方法最初是由Spyridiaki與Siskos聯(lián)合研究出來的［10］，他們通過實驗模擬提高了以下物質(zhì)檢測時的溶出度，包括Neu5Ac，Neu5Gc，N-乙?；?9-O-乙酰神經(jīng)氨酸等。在分析中使用了多種親脂的陽性離子對，如四辛基溴化銨（TOA-Br）三異丙醇胺（TIP），或者三乙醇胺（TEA）等。使用時一般選用TIP，因為它的強度和分離度更好，但在操作中必須要注意pH的控制，（最佳值為3.5），這是決定因素。但是實驗發(fā)現(xiàn)，當這種方法應用到血清、尿液、唾液當中時，只能區(qū)分兩種形式的唾液酸（Neu5Ac and Neu5Ac2en）［11］，在純化步驟中必須除去蛋白質(zhì)。由于其限制條件較多，因此在分析結(jié)構(gòu)較多的唾液酸混合物時不推薦使用本方法。

1.2.3 氣相色譜法

氣相色譜法（GC）與質(zhì)譜法聯(lián)用起初是用來鑒定苷脂鍵及衍生反應后的氧代神經(jīng)氨酸，Zanetta等人在此基礎(chǔ)上研究了一種非常有效的方法，用來測定唾液酸標準液及生物體液如馬血清及牛、羊、馬的下顎下腺粘蛋白等［12］。這種方法是在無水甲醇和使用七氟酸酐形成的揮發(fā)性衍生物存在的前提下，通過重氮甲烷酐的甲基酯化進行氣相色譜/質(zhì)譜電子轟擊的。這種方法能夠區(qū)分大部分的唾液酸，包括O-?；腘eu5Ac，Neu5Gc和8-O-鄰甲基和8-O-硫酸衍生物以及1，7-唾液酸內(nèi)酯。在后面的研究中，這個研究小組對本方法做了小的修改，從而對單糖、脂肪酸和氨基酸在人的粘蛋白和尿素當中可以更好定位。樣品仍可以用相同的反應容器，并按照分析唾液酸的方法用GC/質(zhì)譜進行分析。相對于上面的方法，本法的測定范圍更加全面，其應用前景也更加廣泛。

1.2.4 電遷移方法

這種技術(shù)，尤其是毛細管區(qū)帶電泳技術(shù)（CZE），是應用最廣泛的分析檢測糖類結(jié)構(gòu)的方法之一［13］。因此當對唾液酸進行測定時也很容易操作。在最近的研究中，Ortner與Buchberger發(fā)展了一種簡便、快捷并且重現(xiàn)性很好的方法來檢測人血清和標準糖蛋白中的Neu5Ac和Neu5Gc［14］，這種方法是CZEMS（質(zhì)譜），本法用對乙酰氨基酚作為內(nèi)標物。CZE和MS的連用檢測能夠在排除基質(zhì)干擾的條件下定量分析化合物，線性范圍保持在10～100μg/mL內(nèi)，同時LOD值為2μg/mL。

2 神經(jīng)節(jié)苷脂

2.1 提取、分離、及純化神經(jīng)節(jié)苷脂

在動物組織中，最初以及最常用的的提取分離純化方法是由Folch等人研究的［15］。第一步是使用不同比例的氯仿和甲醇提取總脂成分。第二步，將神經(jīng)節(jié)苷脂從此成分中分離純化出來，利用鹽在水相中的分配比不同提取。這些基本的方法隨著發(fā)展已經(jīng)發(fā)生了一些變化，但最終目標都是為了提高目標產(chǎn)物的含量。

2.2 神經(jīng)節(jié)苷脂的測定

總神經(jīng)節(jié)苷脂量可以通過分離純化唾液酸內(nèi)容物來定量，量化結(jié)果可以用脂鍵聯(lián)合唾液酸的方式表達。

不管總神經(jīng)節(jié)苷脂的鑒別還是定量都需要一種有效的分離方法，主要的方法有薄層色譜法（TLC），高效薄層色譜法（HPTLC）以及層色譜法（LC）［16］。

2.2.1 薄層色譜/高效薄層色譜

薄層色譜法屬于傳統(tǒng)技術(shù)，受到廣泛應用。目前，高效薄層色譜法使用的是二氧化硅60，能提供高分辨率來分離神經(jīng)節(jié)苷脂。不使用以往常用的塑料和玻璃板塊是因為間苯二酚-HCl常會對板塊染色，而鋁塊是因其不能抵抗酸的腐蝕。對于樣品的應用，脂類結(jié)合的唾液酸推薦量是5～10μg。

關(guān)于顯影劑，總混合物的比例為CHCl3：MetOH：0.2％CaCl2（55：45：5，v/v/v）［17］，在此比例下能夠表現(xiàn)良好的重現(xiàn)性，且能夠分離出最重要的神經(jīng)節(jié)苷脂（GM3and GD3），甚至能在其脂肪酸和鞘氨基醇堿基組成的基礎(chǔ)上分離同種神經(jīng)節(jié)苷脂。

2.2.1.1 經(jīng)典測定方法

歷史上，第一次用于染色的試劑是地衣酚，因為它能與糖的反應連接脂類，稱粉甲紫染色法。其缺點是對神經(jīng)節(jié)苷脂不具有專一性。斯文納霍爾姆通過采用間苯二酚檢測，在100℃下反應15min后，顏色變成了藍紫色，中性和硫化的神經(jīng)節(jié)苷脂則變成黃棕色，可以說這是最有效和敏感的檢測試劑［18］。神經(jīng)節(jié)苷脂可以通過與牛腦或其他物種或組織的標準樣對照從而得到鑒定。為了準確觀察樣品板是否被顯色試劑染色，需要用到光密度計，可將光密度計波長設(shè)為580nm進行測定。這種方法可重復操作，用于簡單快速的測定動物組織中的神經(jīng)節(jié)苷脂，甚至被用來確定細胞系和在樣品中GM3和GD3以及GT3的神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1，GM2，GM3，GD1a，GD1b和GT1b）。另一種可能性是通過計算機輔助，在二維高效液相色譜處理后對密度進行成像，通過圖像分析儀處理間苯二酚染色板和用計算機軟件處理，允許測定GM3，GM1a，GD1a的線性在（r＞0.99）0.01nmol和5nmol之間［19］。光密度測定方法比電腦成像密度方法更加靈敏和精確。

2.2.1.2 質(zhì)譜分析測定

質(zhì)譜（MS）能夠利用薄層色譜與高效液相色譜板來鑒別及定量神經(jīng)節(jié)苷脂，雖然這種方法的靈敏性較TLC/HPTLC免疫染色法低，但這兩種方法都可以作為薄層掃描法測定神經(jīng)節(jié)苷脂的補充方法。薄層色譜法與快原子轟擊（FAB）及質(zhì)譜連用的優(yōu)點歸因于FAB-MS與氣相、液相及超臨界流體色譜儀是從生物反應表面得出結(jié)果的最有效方法［20］。TLCFAB-MS連用效率高且省時，但條件是仍然需要大分子的解吸附來增加靈敏度，并盡量減少基質(zhì)中離子源的污染。因此，這種方法對樣本的要求很高，在實際的應用中也會受到一定的限制。

2.2.2 液相色譜法與質(zhì)譜法聯(lián)用

近幾年，一項液相色譜法與質(zhì)譜法連用的技術(shù)逐步發(fā)展起來，實驗證明，這種方法能夠用于牛奶及嬰兒配方中的神經(jīng)節(jié)苷脂中GD3和GM3的測定。其GD3與GM3的重現(xiàn)性分別小于5％和14％，其覆蓋范圍在83％～87％［21］。由于本法的重現(xiàn)性比較低，所以不建議直接應用，在進一步研究及改進之后，相信本方法會成為一種可靠的分析方法應用到實際操作中去。

3 結(jié)論

分光光度法不僅可以將生物試樣中的唾液酸進行定量分析，還可以將總神經(jīng)節(jié)苷脂量進行分析測定，因此現(xiàn)在仍然是主要的分析方法。其應用方式主要為脂類與唾液酸的聯(lián)合應用。而色譜技術(shù)能夠?qū)煞N主要結(jié)構(gòu)的唾液酸進行區(qū)分，這種方法不僅可以測定樣品的原始數(shù)據(jù)還可以檢測在臨床環(huán)境中唾液酸代謝情況的變化（如癌癥的早期診斷）［22］。

神經(jīng)節(jié)苷脂在生物試樣中的檢測都需要一系列冗長的準備工作，如提取、分離以及純化工作，但這又是最關(guān)鍵性的操作步驟，因為這些步驟可以從根本上反應出實際的損耗，要將所有干擾源消除非常困難，只能盡量減少。所以在分析過程中，一定要認真將此前期工作認真準備。

TLC/HPTLC仍然是分離神經(jīng)節(jié)苷脂的重要方法。在所有方法當中，免疫染色法是鑒別神經(jīng)節(jié)苷脂的最有效技術(shù)，而分光光度法可以實現(xiàn)定量。但后者由于具有專一性，因此具有更高的靈敏度和容量來得到結(jié)構(gòu)信息，在實驗操作中也應用的更加廣泛。

神經(jīng)節(jié)苷脂測定的未來趨勢是利用質(zhì)譜分析來闡釋所有結(jié)構(gòu)的神經(jīng)節(jié)苷脂、糖鏈、脂肪酸以及鞘氨基醇，并且調(diào)節(jié)他們的生物活性。本文對多種分析方法做了分析與比較，為神經(jīng)節(jié)苷脂的開發(fā)利用提供了理論和一定的實驗依據(jù)，這就是分析所有鑒別方法的意義所在。

［1］Klenk E，Hoppe-Seyler’s Z.Neuraminsaure.das Spaltprodukt eines neuen Gehirnlipoids［J］.Physiol.Chem，1941，268：50-58.

［2］Varky A，in：R.Cummolings，J.Esko，H.Freeze，G.Hart，J.Marth（Eds.）.Essentials of glycobiology［M］.CSHL Press，New York，1999，25-40.

［3］Reglero A，Bravo I G，F(xiàn)ernandez-Martínez V.Sialic acids：ocurrence，metabolism and biological functions［J］.An.R.Acad.Nac.Farm.2007，73：833-871.

［4］Abad J A，Robotti A，Neurochem J.Regulation of axonal developmentbyplasma membranegangliosides［J］.Neurochem.2007，103：47-55.

［5］寧娜，陳乃宏.神經(jīng)節(jié)苷脂的生物學活性［J］.生理科學進展，2009，40（1）：24-30.

［6］王海龍，孫潤廣，張靜，等.神經(jīng)節(jié)苷脂的紅外、紫外光譜分析及其多聚體結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡觀測［J］.光譜學與光譜分析，2009，29（4）：1045-1049.

［7］Varki N M，Varki A.A second uniquely human mutation affecting sialic acid biology［J］.Lab.Invest.，2007，87：851-857.

［8］Pérez-AguilarR，Genta S，SánchezS.Renal gangliosides are involved in lead intoxication［J］.J.Appl.Toxicol.，2008，28：122-131.

［9］SusilFrancis Fernando，Brad William Woonton.Quantitation of N-acetylneuraminic（sialic）acid in bovine glycomacropeptide［J］.Food Composition and Analysis.，2010，4（23）：359-366.

［10］Ortner K，Buchberger W，Electrophoresis.Determination of sialic acids released from glycoproteins using capillary zone electrophoresis/electrospray ionization mass spectrometry［J］.Electrophoresi.，2008，29：2233-2237.

［11］Galuska S P，Geyer R，Muhlenhoff M，Geyer H.Characterization of oligo-and polysialic acid by MALDI-TOFMS［J］.Anal.Chem.，2007（79）：7161-7169.

［12］王華，徐媛，梁鋒，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分離鑒定單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂中的雜質(zhì)［J］.色譜，2009，27（1）：29-33.

［13］尕瑞，鄭永彪.高效液相色譜法分離測定神經(jīng)節(jié)苷脂GM1中唾液酸的含量［J］.青海醫(yī)藥雜志，2009，39（3）：49-50.

［14］Hara S，Takemori Y，Yamaguchi M，et al.Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl-and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera，glycoproteins and glycolipids［J］.Anal.Biochem，1987，164：138-145.

［15］Hashii N，Kawasaki N，Nakajima N，et al.Study on the quality control of cell therapy products［J］.J.Chromatogr.A 2007，1160：263-269.

［16］Sánchez-Juanes F，Alonso J M，Zancada L，P.Hueso.Glycosphingolipids from bovine milk and milk Fat globule membranes：a comparative study.Adhesion to enterotoxigenic escherichia coli strains［J］.Biol.Chem.，2009（390）：31-40.

［17］Ferreira L，Villar E，Munoz-Barroso I.Conformational changes of newcastle disease disease virus envelope glycoproteins triggered by gangliosides［J］.Int.J.Biochem.Cell Biol.，2004，36：2344-2356.

［18］Gabius H J.Glycans：bioactive signals decoded by lectins［J］.Biochem.Soc.Trans.，2008，36：1491-1496.

［19］Distler U，Hülsewig M，Souady J，K，J.Haier，N.Senninger，A.W.Friedrich，H.Karch，F(xiàn).Hillenkamp，S.Berkenkamp.Gangliosides are potential targets for adjuvant therapy in panceratic cancer［J］.Cancer Ther.，2008，80：1835-1846.

［20］馬莉莎，劉仲華，隋彩珍.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療急性腦梗死64例療效觀察［J］.山東醫(yī)藥，2009，（5）：44.

［21］劉長鎖，陳乃宏.中國資源生物技術(shù)與糖工程學術(shù)研討會論文集［C］.山東：山東省科學技術(shù)協(xié)會，2005.

［22］Matsuno K，Suzuki S.Simple fluorimetric method for quantification of sialic acids in glycoproteins［J］.Anal.Biochem.，2008，375：53-59.