胡艷秋 石 浩

（浙江工業(yè)大學(xué)，浙江 杭州 310014）

0 前言

甜葉菊又名甜菊，屬菊科、斯臺(tái)維亞屬的多年生草本植物。原產(chǎn)南美巴拉圭與巴西兩國(guó)交界的阿曼拜山脈中，當(dāng)?shù)赝林搴茉缇蛯⑻鹁兆鳛樘橇鲜褂?，比如做甜茶、飲料等?/p>

甜菊糖苷（steviol glycosides，SGs）是從甜葉菊葉片中提取出來(lái)的一類(lèi)天然甜味劑，到目前為止，至少已分離出8種不同甜度的糖苷。其中Stevioside為主要成分，甜度為蔗糖的143倍，而熱量?jī)H為蔗糖的1/300，甜味好，特別適合三高人群。通過(guò)致突變、致癌、致畸試驗(yàn)及急性毒性和亞急性毒性研究表明，甜菊苷具有安全低毒的特點(diǎn)，已獲得了中國(guó)衛(wèi)生部、中國(guó)食品添加劑協(xié)會(huì)、美國(guó)食品及藥物管理局（FDA）的認(rèn)證，在全世界廣泛地用作天然甜味劑或營(yíng)養(yǎng)食品補(bǔ)充劑。

甜菊醇（Steviol）為甜菊苷的苷元，分子具有對(duì)映-貝殼杉烯型四環(huán)二萜骨架結(jié)構(gòu)，而對(duì)映-貝殼杉烯型二萜類(lèi)化合物大多具有廣泛的生理活性，如清熱解毒、抗菌消炎、抗腫瘤等作用［1-2］。藥理研究顯示，甜菊醇可降低倉(cāng)鼠腸道內(nèi)的ATP含量和吸收面積，從而抑制葡萄糖的吸收，并可以降低線粒體酶的活性而不影響Na+、K+、ATP酶的活性［3］。Kelmer-Bracht等通過(guò)對(duì)甜菊中的成分對(duì)大鼠肝臟線粒體的影響研究發(fā)現(xiàn)，甜菊醇對(duì)氧化磷酸化具有一定的抑制作用，而其對(duì)ATP/ADP轉(zhuǎn)化和氧化磷酸化的抑制作用，可能是通過(guò)對(duì)磷酸化的解耦聯(lián)作用及對(duì)呼吸鏈酶的抑制作用實(shí)現(xiàn)的［4］。

1 甜菊醇的制備

1.1 化學(xué)合成法

甜菊醇在酸性條件下不穩(wěn)定，易發(fā)生Wagner-Meerwein重排，從而變成其同分異構(gòu)體異甜菊醇，所以不能通過(guò)甜菊苷酸水解的方法制備。1963年Mosetting等人［5］首次報(bào)道確定了甜菊醇和異甜菊醇的絕對(duì)構(gòu)型：

在20世紀(jì)80年代，Ogawa等［6］報(bào)道了甜菊醇的化學(xué)合成方法。甜菊醇可由甜菊苷（stevioside）經(jīng)高碘酸鈉或四醋酸鉛氧化，再經(jīng)堿水解得到：

此法需要大量的高碘酸鈉將甜菊糖分子中的糖苷打成碎片，獲得的甜菊醇產(chǎn)率較低，且要經(jīng)過(guò)多次的重結(jié)晶才能得到較純的產(chǎn)物。

1.2 蝸牛酶水解法

降解天然產(chǎn)物及多糖的方法已有很多報(bào)道，比如：化學(xué)水解法；專(zhuān)一性酶降解法；非專(zhuān)一性酶降解法。目前，國(guó)際上多采用酶法降解天然產(chǎn)物及多糖。我國(guó)學(xué)者劉鑄晉［7］曾報(bào)道了用蝸牛酶水解甜菊糖苷的方法。蝸牛酶中含有β-糖苷酶，在降解甜菊糖苷時(shí)以?xún)?nèi)切方式切斷β（1-4）糖苷鍵。具體的水解方法如下：

1.3 微生物發(fā)酵法

Oliveira等人［8］將甜菊糖置于含有赤霉菌Gibberella fujikuroi的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可得到甜菊醇。

1.4 從天然植物中提取分離得到

我國(guó)學(xué)者張巧云［9］以甜茶葉為原料，水提物經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附、75％乙醇洗脫、無(wú)水乙醇精制，得到甜茶葉總提取物。再經(jīng)聚酰胺柱，硅膠柱層析和重結(jié)晶等方法從該提取物中分離得到了甜菊醇，這是首次從甜茶提取物中分得。

2 甜菊醇的結(jié)構(gòu)修飾及其活性

甜菊醇的對(duì)映-貝殼杉烯型結(jié)構(gòu)具有良好的生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，因此，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)其進(jìn)行了一系列結(jié)構(gòu)修飾及活性研究。目前，對(duì)甜菊醇的結(jié)構(gòu)改造大多集中在13位羥基、4位羧基以及16和17位的碳碳雙鍵部位。

2.1 13位羥基及4位羧基部位的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾

經(jīng)過(guò)多年的研究，人們認(rèn)為甜菊醇C-16和C-17之間的一個(gè)雙鍵能影響細(xì)胞色素P-450傳遞的代謝活性，它能產(chǎn)生至今仍未被人們所認(rèn)識(shí)的誘變因子。甜菊醇第13位羥基團(tuán)是誘變的表現(xiàn)式，但在13位上的乙酰化會(huì)阻止其誘變活性。并且還發(fā)現(xiàn)具有代謝活性的甜菊醇在能觀察到有誘變活性的濃度范圍內(nèi)是很有殺菌活力的［10］。

甜菊醇的環(huán)外雙鍵具有生物活性，但是它在酸性介質(zhì)中又相當(dāng)?shù)牟环€(wěn)定，Khaibullin等人［11］采用了KOH-DMSO體系，對(duì)甜菊醇的4位羧基進(jìn)行酯化反應(yīng)，該方法有效地降低了甜菊醇在反應(yīng)中發(fā)生重排的可能性。

根據(jù)生源學(xué)說(shuō)，赤霉素和甜菊醇均由乙酸板塊通過(guò)甲瓦龍酸，貝殼杉烯酸等中間體次生代謝而來(lái)，它們具有同源性。在母體結(jié)構(gòu)上，赤霉素和甜菊醇十分相似：

在植物體內(nèi)的生物合成途徑中，凡在C-13位上具有羥基的赤霉素類(lèi)似物的生物合成均可能經(jīng)過(guò)了以甜菊醇為中間體的階段。因此，甜菊醇與赤霉素有著密切的關(guān)系，生物活性與赤霉素類(lèi)似，能調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)。甜菊醇與赤霉素的生長(zhǎng)有關(guān)，促進(jìn)赤霉素的生物合成。Bearder等［12］發(fā)現(xiàn)甜菊醇在赤霉菌突變體B1-14a的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)槌嗝顾谿A1、HA19等。

柏正武等人［13］將一些生物活性基團(tuán)和甜菊醇化合物連接合成8個(gè)化合物：

并將這些化合物和水對(duì)照，做了棉花拌種和小麥拌種試驗(yàn)。其中化合物4、6、7、8對(duì)作物的生長(zhǎng)有較好的促進(jìn)作用，發(fā)芽率分別為75％、69％、69.5％、82.5％。甜菊醇對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可能是通過(guò)轉(zhuǎn)化為赤霉素而實(shí)現(xiàn)，以赤霉素的生理機(jī)能表現(xiàn)出來(lái)。

劉秀芳等人［14］以甜菊醇為起始原料，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造：

然后將這些化合物和赤霉素對(duì)照，做了水稻發(fā)芽試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)在化合物10、11以及赤霉素的作用下，水稻的發(fā)芽率分別為98％、92％、100％，胚芽長(zhǎng)為2.8cm、2.0cm、2.8cm。表明了這些化合物在促進(jìn)水稻發(fā)芽、胚芽生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出與赤霉素相當(dāng)?shù)幕钚浴?/p>

2.2 雙鍵部位的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾

Khaibullin等人［15］采用了一種新的更為簡(jiǎn)便的方法，對(duì)雙鍵進(jìn)行氫化加成。新方法以Raney nickel為催化劑，用水合肼作為反應(yīng)試劑，取代了之前用H2-Pd/C的反應(yīng)體系（會(huì)產(chǎn)生差向異構(gòu)體12-1和12-2），新的方法更經(jīng)濟(jì)，而且立體選擇性強(qiáng)（反應(yīng)只生成化合物12-1）。正如預(yù)期的一樣，反應(yīng)所得化合物在濃度為20％的硫酸中加熱后，沒(méi)有發(fā)生重排。

2.3 形成二聚物

Lin L H等人［16］將甜菊醇的一系列衍生物在PyBOP和DIEA的作用下與脂肪烷基胺或脂肪烷基二胺反應(yīng)，制備其酰胺二聚物，并運(yùn)用MTT分析法研究了該系列化合物對(duì)癌細(xì)胞及人胚胎肺細(xì)胞的細(xì)胞毒素作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物13對(duì)癌細(xì)胞株HL260、HepG2、H460及人胚胎肺細(xì)胞株MRC25有抑制作用。

其IC50值（μmol·L-1）分別為4.3±0.3、17.9±0.3、10.7±0.65及17.0±1.2。通過(guò)對(duì)該化合物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，二聚物對(duì)癌細(xì)胞不同的細(xì)胞毒作用與二聚物間不同的鏈長(zhǎng)相關(guān)，這可能是由于不同的鏈長(zhǎng)可以改變配體與受體間的相互作用，從而對(duì)生物活性產(chǎn)生影響。

2.4 甜菊醇的氧化

Hanson J R和Oliveira B H［17］利用黑曲霉菌和赤霉菌等真菌將甜菊醇進(jìn)行了微生物轉(zhuǎn)化，生成化合物14，Yang L M等人［18］利用B.megaterium ATCC 14581，M.recurvatus MR 36，和A.niger BCRC 32720對(duì)甜菊醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，得到了多個(gè)羥基代謝物（14-18）。

此研究證明，這種生物轉(zhuǎn)化羥基化的方法是區(qū)域選擇性和立體選擇性地引入羥基的一種非常有效的方法，也被應(yīng)用于其他二萜型二萜化合物，而且，天然化合物的微生物轉(zhuǎn)化在腫瘤抑制劑的發(fā)展中具有很高的價(jià)值。

2.5 引入α-環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮活性基團(tuán)

對(duì)映-貝殼杉烯型二萜化合物具有廣泛的生理活性。其中，許多對(duì)映-貝殼杉烯型二萜化合物的抗腫瘤活性與其分子中具有α-環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)有關(guān)，該結(jié)構(gòu)可以與受體氨基酸的親核基團(tuán)，如氨基、羥基等發(fā)生不可逆Micheal親核加成反應(yīng)，從而體現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性［19］。

由于具有α-環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)的對(duì)映-貝殼杉烯型二萜化合物主要來(lái)自于天然產(chǎn)物，化合物來(lái)源有限。天然、廉價(jià)易得的甜菊醇亦具有對(duì)映-貝殼杉型結(jié)構(gòu)，但因分子中沒(méi)有α-環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮基團(tuán)，抗菌、抗腫瘤活性不強(qiáng)。通過(guò)對(duì)甜菊醇分子的結(jié)構(gòu)改造，向分子中引入α-環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮活性基團(tuán)，可獲得新的抗腫瘤先導(dǎo)化合物。

張大永等人［20］以甜菊醇為原料，向分子中引入了以α-環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮為特征的活性基團(tuán)，同時(shí)對(duì)C-4位羧基進(jìn)行了修飾，以改善目標(biāo)化合物的活性。因胺型二萜化合物易與α-環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮反應(yīng)，在制備含氮衍生物時(shí)，應(yīng)首先進(jìn)行羧酸的衍生化再構(gòu)建α-環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮基團(tuán)。羥基保護(hù)時(shí)，因?yàn)槲蛔柙?，相比C-19位羥基，C-13位羥基不易被乙酰化。目標(biāo)化合物20-24、26-29、32-34（路線1）化合物38（路線2）的合成方法如下所示：

將目標(biāo)化合物用人肝癌細(xì)胞系（BEL-7402），人卵巢癌細(xì)胞系（HO-8910），人乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7）以及人急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系（HL-60）進(jìn)行活性測(cè)試?；衔?0-24、26-29、32-34、38均表現(xiàn)出較好的細(xì)胞毒活性。事實(shí)證明了α-環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)是關(guān)鍵的藥效基團(tuán)。其中，酰胺化合物（26-29）表現(xiàn)出相對(duì)較好的抑制活性，可能與其較適中的油水分配系數(shù)有關(guān)。與單純酯基相比，在酯基端位上連接哌啶基的化合物（32-34）有較好的活性，判斷可能是哌啶取代基能增加水溶性，起到了增強(qiáng)細(xì)胞毒活性的作用。C-4位取代基類(lèi)型對(duì)細(xì)胞毒活性影響較大。

3 結(jié)語(yǔ)

在藥物研發(fā)方面，目前臨床應(yīng)用的藥物1/3以上源自天然產(chǎn)物。它們有的直接來(lái)自天然產(chǎn)物，有的是以天然產(chǎn)物的活性成分為先導(dǎo)進(jìn)一步發(fā)展的衍生物、類(lèi)似物或全合成產(chǎn)物。甜菊醇來(lái)源于甜菊苷，甜菊苷來(lái)源廣，毒副作用低，而且已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此，選擇甜菊醇作為先導(dǎo)化合物，利用前藥原理、拼合原理、生物電子等排原理等對(duì)其進(jìn)行合理結(jié)構(gòu)修飾，以改善其水溶性和脂溶性，改變其在體內(nèi)的脂水分布系數(shù)，提高其生物利用度及選擇性，增強(qiáng)其藥理活性，進(jìn)行新藥的研究與開(kāi)發(fā)，將具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］Fujita T，Takeda Y，Yuasa E，et al.Structure of inflexinol，a new cytotoxic diterpene from Rabdosia inflexa［J］.Phytochemistry，1982，21（4）：903-905.

［2］Fuji K，Node M，Ito N，et al.Terpenoids.L.Antitumor activity of diterpenoids from Rabdosia shikokiana var.occidentalis［J］.Chem Pharm Bull，1985，33（3）：1038-1042.

［3］Toskulkao C，Sutheerawattananon M，Piyachaturawat P.Inhibitory effect of steviol，a metabolite of stevioside，on glucose absorption in everted hamster intestine in vitro［J］.Toxicol Lett，1995，80：153-159.

［4］Kelmer Bracht A，Alvarez M，Bracht A.Effects of Stevia rebaudiana natural products on rat liver mitochondria［J］.Biochem Pharmacol，1985，34：873-882.

［5］Mosetting E，Beglinge U，et al.J.Am.Chem.Soc［J］.1963，85：2305.

［6］Ogawa T，Nozaki M，Matsui M.Total synthesis stevioside［J］.Tetrahedron，1980，36（18）：2641-2648.

［7］劉鑄晉，周文華，高峰，等.甜葉懸鉤子葉的甜味成分研究［J］.植物學(xué)通報(bào)，1983，01：33-37.

［8］Heleno de Oliveira，Bras，F(xiàn)erreira da Trindade，Jose Luiz.Production of hydroxysteviol and its application as a plant growth regulator：Brazil，2004006278［P］.2006-08-22.

［9］張巧云.廣西甜茶中甜茶素和其他化學(xué)成分的研究［D］.廣西師范大學(xué)，2007.

［10］劉樹(shù)楷，鄭建仙.良好的天然甜味劑-甜菊苷［J］.中國(guó)甜菜糖業(yè)，1992，3：50-58.

［11］Khaibullin R N，Strobykina I Yu，Kataev V E，et al.O-Alkylation of Diterpenoid Steviol in the System KOH-DMSO［J］.Russian Journal of General Chemistry，2009，79（5）：2197-2200.

［12］John R，Bearder J M，Colin M W.Phytochemistry，1975，14（8）：1741.

［13］柏正武，劉秀芳，徐漢生.甜葉醇衍生物的合成及其生物活性［J］.應(yīng)用化學(xué)，1993，10（4）：35-38.

［14］劉秀芳，黃曦，徐漢生.甜葉醇的結(jié)構(gòu)改造及生物活性試驗(yàn)［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，2：74-78.

［15］Khaibullin R N，Strobykina I Yu，Kataev V E，et al.New Synthesis of Diterpenoid（16S）-Dihydrosteviol［J］.Russian Journal of General Chemistry，2009，79（5）：967-971.

［16］Lin L H，Lee L W，Sheu S Y，et al.Study on the stevioside analogues of steviolbioside steviol and isosteviol 19-alkyl amide dimers：synthesis and cytotoxic and antibacterial activity［J］.Chem Pharm Bull，2004，52（9）：1117-1122.

［17］JamesR Hanson，BrasH De Oliveira.The microbiological transformation of steviol derivatives by Rhizopus stolinifer and Gibberella fujikuroi［J］.Phytochemistry，1990，29（12）：3805-3807.

［18］Yang Li Ming，Hsu Feng Lin，Chang Shwu Fen，et al.Microbial metabolism of steviol and steviol 16α，17-epoxide［J］.Phytochemistry，2007，68（4）：562-570.

［19］Lee C N，Wong K L，Liu J C，et al.Inhibitory effect of stevioside on calcium Influx to produce antihypertension［J］.Planta Med，2001，67：796-799.

［20］張大永，湯涌，王可，等.ent-貝殼杉烯型二萜化合物的合成及其抗腫瘤活性［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41（1）：20-25.