張莉,高志軍,趙靜(.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院,拉薩市850000;.西藏當(dāng)雄縣人民醫(yī)院,當(dāng)雄縣85500)
嚴重?zé)隣C傷早期因腸黏膜屏障功能受損會導(dǎo)致腸道細菌和內(nèi)毒素移位,激活炎癥以及后續(xù)的代償性抗炎反應(yīng)和免疫系統(tǒng)自我保護作用,最終導(dǎo)致機體免疫失衡,從而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),進而導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(Multiple Organs Dysfunction syndrome,MODS)。國外研究證實,大鼠Toll樣受體4(TLR4)信號通路及下游相關(guān)的效應(yīng)分子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)參與了燒傷后炎癥的發(fā)生[1]。有研究發(fā)現(xiàn),作為TLR4的配體脂多糖(LPS)也在燒傷后續(xù)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[2,3]。
美寶濕潤燒傷膏(MEBO)主要成分包括黃連、黃柏、黃芩、地龍、罌粟殼,具有清熱、解毒、止痛、生肌功效,廣泛用于治療各種燒、燙、灼傷。在本研究中,筆者將MEBO運用于燙傷大鼠,觀察其對燙傷大鼠創(chuàng)面愈合和TLR4/LPS信號通路及TNF-α、IL-6的影響,初步闡明其對燙傷后炎癥的相關(guān)作用機制,為燒燙傷創(chuàng)面愈合的臨床治療提供理論依據(jù)。
FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD公司);680型全波長酶標(biāo)檢測儀(美國Bio-Rad公司);721型分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司);內(nèi)毒素檢測試劑(鱟試劑)動態(tài)檢測儀(北京時代新光生物技術(shù)有限公司)。
MEBO(汕頭市美寶制藥有限公司,批號:Z20000004);鱟試劑(上海坤肯生物化工有限公司);PE標(biāo)記的大鼠TLR4單克隆抗體、FITC標(biāo)記的鼠免疫球蛋白G(IgG)均購自美國BD公司;紅細胞裂解液、TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒(深圳晶美生物技術(shù)公司)。
大鼠30只,♂,體重280~320 g,由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供(動物合格證號:24301050)。
將30只SD大鼠隨機均分為空白對照、模型對照和MEBO組。除空白對照組外,其它大鼠在清醒狀態(tài)下,以200 g·L-1硫化鈉背部脫毛;200 g·L-1的烏拉坦溶液按5 mL·kg-1ip麻醉,置電熱恒浴中致背部燙傷(108℃,8 s),復(fù)制深Ⅱ度(經(jīng)病理證實)燙傷模型,燙傷后ip生理鹽水(40 mL·kg-1)抗休克。創(chuàng)面處理方式:模型對照組大鼠燙傷后讓創(chuàng)面暴露;MEBO組大鼠燙傷后涂MEBO于創(chuàng)面(厚度薄于1 mm),每8 h更換新藥。注意換藥前需將殘留在創(chuàng)面上的藥物及液化物拭去,同時暴露創(chuàng)面。燙傷后大鼠分籠飼養(yǎng)。觀察期間未發(fā)生明顯感染癥狀。
將空白對照和MEBO組大鼠在燙傷后各時相點麻醉,無菌條件下經(jīng)尾靜脈采集靜脈血,一部分置于去熱源肝素化試管中,3 000 r·min-1、4℃下收集血漿;一部分置于去內(nèi)毒素的干凈試管中自凝,3 000 r·min-1、4℃下收集血清。樣本于-70℃貯藏,備用。
每日觀察傷口愈合情況,以創(chuàng)面完全上皮化、無滲出作為創(chuàng)面完全愈合依據(jù),同時記錄創(chuàng)面愈合時間;按Nagelschmidt法[6]計算各時相點創(chuàng)面愈合率:用透明稱量紙(7.5 cm×7.5 cm,平均重量約為0.156 8 g)覆蓋于大鼠背部創(chuàng)面,將創(chuàng)面邊緣清晰描繪在透明稱量紙上,僅保留曲線繪制所圍的面積并稱重。創(chuàng)面面積=(7.5 cm×7.5 cm×紙片重)/0.156 8 g;創(chuàng)面愈合率/%=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。
參考鱟試劑檢測說明書,采用濁度法(內(nèi)毒素檢測法)檢測各組大鼠血漿中內(nèi)毒素含量。其原理是當(dāng)被檢測的樣品中含有內(nèi)毒素時,鱟試劑會變混濁。內(nèi)毒素含量與混濁程度呈正比,可準(zhǔn)確量化被檢測樣品中內(nèi)毒素的含量。顯色后采用分光光度計于540 nm波長處測定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得大鼠血漿中LPS含量。
采用ELISA檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6的表達水平,按說明書進行操作。
抽取EDTA抗凝靜脈血2 mL,采用細胞分離柱方法進行,在無菌情況下采用淋巴細胞分離液方法分離淋巴細胞,熒光抗體標(biāo)記的淋巴細胞懸液4℃條件下避光孵育30 min,PBS洗滌3次,每次5 min。取1×106個·mL-1細胞標(biāo)記的抗TLR4-PE單克隆抗體和抗FITC-IgG單克隆抗體,上流式細胞儀進行檢測。
所有計量資料均采用±s表示;TNF-α含量、IL-6含量用χ2檢驗行統(tǒng)計學(xué)分析;LPS含量用t檢驗及單因素方差分析。采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計,P<0.05為差異有顯著性。
相對于模型對照組[(22.83±2.82)d],MEBO組大鼠創(chuàng)面愈合時間[(17.25±1.78)d]顯著縮短(P<0.01)。各組大鼠創(chuàng)面愈合時間見表1。
表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合時間(±s,n=10)Tab1 Healing time of wound in each grou(±s,n=10)
表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合時間(±s,n=10)Tab1 Healing time of wound in each grou(±s,n=10)
與模型對照組比較:*P<0.01vs.model control group:*P<0.01
創(chuàng)面愈合時間/d 22.83±2.82 17.25±1.78*組別模型對照組MEBO組
在傷后的前3天,MEBO組大鼠與模型對照組比較,創(chuàng)面愈合率無顯著差異(P>0.05);從第7天至第21天,MEBO可明顯促進燙傷大鼠的創(chuàng)面愈合(P<0.01或P<0.05)。不同時相點各組大鼠創(chuàng)面愈合率見表2。
表2 不同時相點各組大鼠創(chuàng)面愈合率(±s,n=10)Tab2 Healing rate of wound in each group at different time point(±s,n=10)
表2 不同時相點各組大鼠創(chuàng)面愈合率(±s,n=10)Tab2 Healing rate of wound in each group at different time point(±s,n=10)
與模型對照組比較:*P<0.05,**P<0.01vs.model control group:*P<0.05,**P<0.01
組別模型對照組MEBO組不同時相點的愈合率/%28 d 100 100 1 d 2.03±0.32 1.98±0.30 3 d 10.69±2.32 11.84±3.89 7 d 36.87±6.25 41.88±8.03*14 d 70.56±12.20 85.46±13.74**21 d 92.07±14.64 100**
傷后第1天至第7天,模型對照組大鼠血漿中LPS含量逐漸升高,于第7天達到頂峰后逐漸降低;與模型對照組比較,從第7天至第21天,不同時相點MEBO可顯著降低燙傷大鼠血漿中LPS含量(P<0.01或P<0.05)。不同時相點各組大鼠血漿LPS含量變化見表3。
表3 不同時相點各組大鼠血漿LPS含量變化(±s,n=10)Tab3 The content of LPS in rat plasma at different time point(±s,n=10)
表3 不同時相點各組大鼠血漿LPS含量變化(±s,n=10)Tab3 The content of LPS in rat plasma at different time point(±s,n=10)
與模型對照組比較:*P<0.05,**P<0.01vs.model control group:*P<0.05,**P<0.01
組別模型對照組MEBO組不同時相點的LPS含量/μg·mL-1 28 d 0.73±0.17 0.69±0.18 1 d 0.70±0.11 0.73±0.10 3 d 0.72±0.14 0.69±0.12 7 d 1.23±0.34 0.91±0.26**14 d 0.98±0.22 0.76±0.19**21 d 0.85±0.18 0.71±0.16*
第1天至第28天,模型對照組大鼠血清中TNF-α的水平逐漸降低;與模型對照組比較,從第7天至第28天,MEBO可有效降低燙傷模型大鼠血漿中TNF-α含量(P<0.01或P<0.05)。不同時相點各組大鼠血清TNF-α含量變化見表4。
表4 不同時相點各組大鼠血清TNF-α含量變化(±s,n=10)Tab 4The content of TNF-α in rat plasma at different time point(±s,n=10)
表4 不同時相點各組大鼠血清TNF-α含量變化(±s,n=10)Tab 4The content of TNF-α in rat plasma at different time point(±s,n=10)
與模型對照組比較:*P<0.05,**P<0.01vs.model control group:*P<0.05,**P<0.01
模型對照組MEBO組0.56±0.19 0.43±0.13**1.38±0.35 1.43±0.38 0.98±0.27 0.93±0.26 0.78±0.18 0.61±0.20*0.70±0.22 0.58±0.18*0.63±0.21 0.51±0.16**
模型對照組大鼠血清中IL-6于第3天達到最高峰,隨后緩慢下降;經(jīng)MEBO處理后,大鼠血清中IL-6的表達水平于第7天開始顯著下降(P<0.01或P<0.05)。不同時相點各組大鼠血清IL-6含量變化見表5。
表5 不同時相點各組大鼠血清IL-6含量變化(±s,n=10)Tab5 The content of IL-6 in rat plasma at different time points(±s,n=10)
表5 不同時相點各組大鼠血清IL-6含量變化(±s,n=10)Tab5 The content of IL-6 in rat plasma at different time points(±s,n=10)
與模型對照組比較:*P<0.05,**P<0.01vs.model control group:*P<0.05,**P<0.01
模型對照組MEBO組110.00±21.44 108.41±21.96 105.33±20.63 104.01±21.63 143.45±23.26 145.54±22.90 135.69±21.77 128.95±20.10*123.33±20.47 117.63±19.92*118.88±20.85 109.79±18.64**
模型對照組大鼠外周血中TLR4百分率逐漸升高,第14天達到最高峰,隨后緩慢下降;與模型對照組比較,MEBO組大鼠外周血中TLR4百分率于第7天開始顯著下降(P<0.01或P<0.05)。不同時相點各組大鼠血漿中TLR4百分率變化見表6。
表6 不同時相點各組大鼠血漿中TLR4百分率變化(±s,n=10)Tab6 Percentage of TLR4 in rat plasma at different time point(±s,n=10)
表6 不同時相點各組大鼠血漿中TLR4百分率變化(±s,n=10)Tab6 Percentage of TLR4 in rat plasma at different time point(±s,n=10)
與模型對照組比較:*P<0.05,**P<0.01vs.model control group:*P<0.05,**P<0.01
組別模型對照組MEBO組不同時相點的TLR4百分率/%1 d 1.70±0.24 1.72±0.22 3 d 2.80±0.33 2.78±0.30 7 d 5.58±0.57 4.65±0.43*14 d 7.58±0.69 6.08±0.53**21 d 5.96±0.94 5.19±0.81*28 d 3.68±0.35 3.30±0.38
燒、燙傷后各種炎癥細胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6大量釋放,從而引發(fā)和加重全身炎癥反應(yīng)[4,5]。近來研究發(fā)現(xiàn),TLR4/LPS信號通路參與了燒傷后全身炎癥的發(fā)生[1]。
TLR家族是模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)中的一大類。TLR在人類進化過程中保持高度保守的分子適應(yīng)性免疫,能識別細菌、真菌、病毒,還包括瘧原蟲等寄生蟲[6]。這種受體最早在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn),對果蠅的天然免疫起重要作用,后來在哺乳動物的體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了這類Toll受體,它們參與、介導(dǎo)了LPS等相關(guān)分子模式誘發(fā)的先天免疫,目前已發(fā)現(xiàn)的TLR有13種(TLR1-13)[7]。
TLR4是第一個被鑒定的人類Toll樣受體,是機體識別細菌LPS的模式識別受體。TLR4與LPS相互作用的機制目前認為:LPS與單個核細胞膜上的脂多糖結(jié)合蛋白(LPS binding protein,LBP)結(jié)合;同時,Toll/IL-1受體家族胞漿區(qū)的接合蛋白——髓樣分化蛋白(Myeloid ifferentiation protein 88,MyD88)分子通過與TLR的相互作用形成復(fù)合物,再通過MyD88分子中的死亡結(jié)構(gòu)域的同嗜作用募集IRAK(IL-1 receptor-associated kinase)與腫瘤壞死因子相關(guān)因子TRAT6(Tummor necrosis factor-associated factor 6)等信號途徑,激活核因子-κB(NF-κB),活化AP-1等轉(zhuǎn)錄因子,從而調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等細胞因子、黏附分子和炎癥因子的轉(zhuǎn)錄表達,進而影響免疫與炎癥反應(yīng)[8]。
在與燒傷相關(guān)的研究中傅穎珺等[9]發(fā)現(xiàn),嚴重?zé)齻麜r大鼠脾臟TLR4 mRNA和蛋白水平以及早期的致炎細胞因子水平均明顯升高;同時研究還發(fā)現(xiàn),嚴重?zé)齻麜rTLR4的上調(diào)可能是通過調(diào)節(jié)性T細胞來實現(xiàn)的。在本研究中筆者同樣發(fā)現(xiàn),燙傷后第14天開始大鼠TLR4的表達水平明顯升高,其結(jié)果與王明青等[10]的研究基本一致。而經(jīng)過EMBO處理后,TLR4在燙傷大鼠外周血中的陽性表達率明顯下調(diào)。
MEBO作為一種有效的燒傷治療藥物,廣泛用于各種燒、燙、灼傷。本研究中,筆者以MEBO運用于燙傷大鼠,發(fā)現(xiàn)MEBO可有效縮短燙傷創(chuàng)面愈合時間并促進燙傷創(chuàng)面的愈合。筆者同樣觀察了燙傷大鼠血清中TLR4/LPS信號通路下游的效應(yīng)分子TNF-α和IL-6的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),燙傷后第1天至第28天,模型對照組大鼠血清中TNF-α的水平逐漸降低,其結(jié)果與現(xiàn)有報道存在一定的差異。作為炎癥早期的致炎細胞因子,燙傷后TNF-α表達水平在24 h內(nèi)迅速升高,隨后逐漸降低。而在本研究中,由于沒有設(shè)定燙傷后更早的時相點,故沒有觀察到TNF-α在燙傷后24 h內(nèi)迅速上升的趨勢。IL-6作為炎癥中晚期出現(xiàn)上升趨勢的細胞因子,筆者觀察到燙傷后第3天IL-6升到最高峰,隨后緩慢下降。而經(jīng)過MEBO處理后,與模型對照組比較,大鼠血清中TNF-α和IL-6的水平明顯降低,提示MEBO具有對TNF-α和IL-6的有效抑制效應(yīng)。
在本研究中,筆者證實了MEBO對于燙傷創(chuàng)面愈合的促進作用,初步闡明了其作用機制可能與抑制TLR4/LPS信號通路及下游的致炎細胞因子TNF-α和IL-6的表達有關(guān)。但是,MEBO是如何調(diào)控TLR4/LPS信號通路中的調(diào)節(jié)分子從而促進燙傷創(chuàng)面愈合的,需要進一步研究。
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