楊瑞儀，盧元媛，楊雪芹，馮麗玲，曾慶平（廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州市 510405）

青蒿素是20世紀70年代由我國科學(xué)家根據(jù)古籍記載及民間驗方首先從中草藥黃花蒿Artemisia annuaL.中發(fā)現(xiàn)并率先應(yīng)用的抗瘧藥。由于其安全性、有效性和速效性，以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療方案被世界衛(wèi)生組織推薦在世界各大主要瘧疾流行區(qū)推廣應(yīng)用。除此以外，青蒿素類藥對于其他傳染?。ㄈ缪x病、乙型肝炎等）和癌癥[1]也具有一定的療效。因此，青蒿素的藥用價值非常大。黃花蒿是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能合成青蒿素的天然植物，但產(chǎn)量很低，僅為0.01%～0.8%左右。有觀點認為，在雙氫青蒿酸前體向青蒿素轉(zhuǎn)化的過程中，青蒿素發(fā)揮著活性氧（Reactive oxygen species，ROS）自由基儲備池的作用，其獨特的過氧橋結(jié)構(gòu)被認為是雙氫青蒿酸淬滅ROS生成氫過氧化物中間體后產(chǎn)生的最終產(chǎn)物[2]。Wallaart TE等[3]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過夜霜季節(jié)后，青蒿素含量升高并伴隨著雙氫青蒿酸的下降，推測霜凍可能作為一種壓力條件啟動了雙氫青蒿酸向青蒿素的轉(zhuǎn)化。在環(huán)境脅迫（冷、熱、強光、干旱、鹽堿等）下，植物中由ROS造成的氧化脅迫是一種普遍現(xiàn)象。雖然氧化脅迫誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物合成的研究已先后在人參、紅豆杉、丹參、長春花中報道，但關(guān)于氧化脅迫與青蒿素合成之間相互關(guān)系的研究相對較少。本研究以低溫為脅迫條件，研究其對黃花蒿氧化還原狀態(tài)及青蒿素合成的影響。

1 儀器與試藥

P680型高效液相色譜儀（美國Dionex公司）；Ultrospec 3300pro型紫外-可見光分光光度計（美國GE公司）；ABI7300型實時熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；SPX-250B-G型微電腦光照培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司）。

黃花蒿種子（重慶酉陽，華陽2號）由廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心鑒定為真品，廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所保存；青蒿素標準品（批號：13806ED）、組氨酸（批號：423834）均購自美國Sigma-Aldrich公司；N，N-二甲基-對-亞硝基苯胺（日本東京化成工業(yè)株式會社，批號：3Q58C）；RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）；RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Fermentas中國公司）；SYBR Green Realtime PCR Master Mix（日本Toyobo公司）；引物由美國Invitrogen中國總公司合成；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 植物培養(yǎng)及低溫處理

黃花蒿種子用70%乙醇浸潤30 s，3%NaOCl浸泡30 min，無菌水漂洗4～5次，均勻散播在1/2 Murashige and Skoog（1/2MS）培養(yǎng)基潤濕的濾紙上避光發(fā)芽。種子發(fā)芽后移至含0.8%瓊脂的1/2MS固體培養(yǎng)基上，25℃光照培養(yǎng)（光周期：16 h光/8 h暗）。種子發(fā)芽30 d后，選取長勢均一的無菌苗移至4℃光照培養(yǎng)箱進行低溫處理（光周期：16 h光/8 h暗）。

2.2 統(tǒng)計學(xué)方法

試驗中每個指標的測定均重復(fù)6個樣本（n＝6），每個樣本測定均重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計，采用配對t檢驗進行顯著性分析。

2.3 低溫對青蒿素合成的影響

青蒿素含量測定：葉片于50℃烘箱中烘24 h，烘干后研成細粉，過篩，精確稱取0.100 g，置于10 mL容量瓶中，加入丙酮10 mL，超聲波提取30 min，用丙酮補足至10 mL。提取液過濾后進樣檢測。同時，精確稱取青蒿素標準品0.010 g，加入甲醇溶解配成濃度為0.298 mg·mL-1的溶液，分別取6、10、14、20、30 μL進樣，制備標準曲線。色譜條件：色譜柱為Phenomenex BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（48∶52，V/V），流速為1 mL·min-1，柱溫為30 ℃，檢測波長為216 nm。以每1 g干重葉片所含青蒿素量來表示青蒿素含量，單位為mg·g-1。

與25℃比較，經(jīng)過4℃低溫處理4 h后，青蒿素含量開始上升（P＜0.05），24 h后上升幅度加大（P＜0.01）。冷刺激4、24和48 h后青蒿素含量分別提高20%、65%和80%。4℃處理對青蒿素合成的影響見圖1。

2.4 低溫對黃花蒿單線態(tài)氧（1O2）和過氧化氫（H2O2）生成的影響

圖1 4℃處理對青蒿素合成的影響（n＝6）與25 ℃對照比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig 1 Effects of 4℃treatment on the biosynthesis of artemisini（nn＝6）vs.25 ℃ controls：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

H2O2的測定參照硫酸鈦沉淀法[4]，以每1 g鮮重葉片中所含H2O2量來表示H2O2濃度，單位為μmol·g-1。1O2的檢測參照文獻[5]，反應(yīng)液中加入有顏色的N，N-二甲基-對-亞硝基苯胺作為1O2的吸收劑，通過N，N-二甲基-對-亞硝基苯胺的漂白反應(yīng)（吸光度（OD）值下降）來檢測1O2的生成。具體來說，5 mL反應(yīng)液（45 mmol·L-1pH7.1 PBS、10 mmol·L-1組氨酸、50 μmol·L-1N，N-二甲基-對-亞硝基苯胺）中加入150 mg剪碎的葉片，空白對照不加葉片。光照（3 000 lx）下反應(yīng)1 h，反應(yīng)液10倍稀釋后讀取440 nm波長處的OD值。按下式計算低溫處理相對于對照條件（25℃）1O2的生成率：[（OD440（空白）－OD440（4℃））/（OD440（空白）－OD440（25℃））]×100%。

在4℃處理過程中，黃花蒿葉片1O2和H2O2的含量都是先升高后降低，在4 h后即達到最大值。以1O2相對生成率（4℃/25℃）來表示低溫處理下1O2的生成變化，處理4 h后1O2上升1倍，隨后下降，在24和48 h分別比對照高40%和30%；H2O2含量在4 h時為對照的1.6倍，并維持至24 h，處理48 h后，H2O2含量回落至略高于對照水平。4℃處理對1O2生成率的影響見圖2；4℃處理對H2O2生成量的影響見圖3。

圖2 4℃處理對1O2生成率的影響（n＝6）與0 h比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig 2Effects of 4℃treatment on the1O2productio（nn＝6）vs.0 h：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.5 低溫對過氧化氫酶（CAT）活性的影響

CAT活性測定參照文獻[6]，精確稱取0.500 g葉片，加入少量石英砂、2 mL 2%聚乙烯吡咯烷酮、100 mg CaCO3，冰浴研磨成勻漿，4 ℃12 000 r·min-1離心 5 min，取上清加入 50 mmol·L-1pH7.0的PBS定容至10 mL，此為CAT粗酶提取液。取10倍稀釋的CAT粗酶提取液1.00 mL，加入10 mmol·L-1H2O22.00 mL，迅速混勻，5 min內(nèi)連續(xù)讀取波長240 nm處的OD值，計算每分鐘的OD值變化（ΔOD240）。以1.00 mL 10倍稀釋的CAT粗酶提取液與2.00 mL H2O的混合液為空白對照。用每1 g鮮重葉片每1 min催化H2O2分解的量來表示CAT活性，單位為μmol·min-1·g-1。

與25℃對照比較，CAT活性在4℃處理4 h后提高了2.2倍，并進一步升高，在24 h達到最大值，為對照的5.3倍。48 h后CAT活性有所下降，但維持在對照的2.8倍水平。4℃處理對CAT活性的影響見圖4。

圖3 4℃處理對H2O2生成量的影響（n＝6）與25℃對照比較：＊P＜0.05Fig3 Effects of 4℃treatment on the production of H2O2（n＝6）vs.25 ℃ controls：＊P＜0.05

圖4 4℃處理對CAT活性的影響（n＝6）與25 ℃對照比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig4 Effects of 4 ℃ treatment on activities of CAT（n＝6）vs.25 ℃ controls：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.6 低溫對黃花蒿基因表達的影響

2.6.1 實時熒光定量PCR（RTFQ-PCR） 取葉片100 mg，按照RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。取1 μg 總RNA，按照RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以10倍稀釋的cDNA為模板與SYBR Green Realtime PCR Master Mix混合，RTFQ-PCR反應(yīng)在ABI7300實時熒光定量PCR儀上進行。定量PCR引物見表1（以actin基因為內(nèi)參，基因的相對轉(zhuǎn)錄水平＝基因mRNA拷貝數(shù)/actin mRNA拷貝數(shù)）。

表1 定量PCR引物Tab1 Primers for real time fluorescence quantitative PCR

2.6.2 低溫對青蒿素生物合成基因表達的影響 經(jīng)過4℃低溫處理24 h后，青蒿素合成相關(guān)基因[3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（HMGR）、法呢基焦磷酸合酶基因（FPS）、紫穗槐二烯合酶基因（ADS）、細胞色素P450單加氧酶基因（CYP71AV1）、細胞色素P450氧化還原酶基因（CPR）和青蒿醛Δ11（13）雙鍵還原酶基因（DBR2）]的表達都普遍上調(diào)。其中ADS和HMGR的上調(diào)幅度較大，轉(zhuǎn)錄水平比對照增加16倍和3.2倍。其余基因CYP71AV1、DBR2、CPR與FPS的mRNA水平分別為對照的2.8、2.5、1.9與1.5倍。4℃處理對青蒿素生物合成基因表達的影響見表2。

2.6.3 低溫對其他萜類合成基因表達的影響 在黃花蒿中，法呢基焦磷酸（FPP）是萜類合成的一個重要的分支起點，除紫穗槐二烯合酶（ADS）以此為底物開始青蒿素合成外，同樣以FPP為底物的萜類合酶還有合成鯊烯的鯊烯合酶（SQS）、合成β-石竹烯的β-石竹烯合酶（CS）、合成（E）-β-法呢烯的（E）-β-法呢烯合酶（FS）以及合成表柏木腦和柏木腦的柏木腦合酶（EPS）等。經(jīng)過4℃低溫處理24 h后，ADS基因表達大幅上調(diào)的同時，各競爭途徑的萜類合酶基因的表達在低溫誘導(dǎo)條件下也呈現(xiàn)不同的變化。SQS和FS基因?qū)Φ蜏卣T導(dǎo)無應(yīng)答，誘導(dǎo)前后表達水平無明顯差異，而EPS基因的表達提高3倍，CS基因的表達則顯著下降近20倍。4℃處理對青蒿萜類合成基因表達的影響見表3。

表2 4℃處理對青蒿素生物合成基因表達的影響（±s，n＝6）Tab2 Effects of 4℃treatment on transcriptional expressions of artemisinin biosynthetic gene（±s，n＝6）

表2 4℃處理對青蒿素生物合成基因表達的影響（±s，n＝6）Tab2 Effects of 4℃treatment on transcriptional expressions of artemisinin biosynthetic gene（±s，n＝6）

與25 ℃對照比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.25 ℃ controls：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

溫度/℃25 4基因mRNA拷貝數(shù)/actin mRNA拷貝數(shù)DBR2 2.05±0.33 5.04±1.68＊＊HMGR 0.08±0.03 0.35±0.03＊＊FPS 0.11±0.02 0.28±0.18＊ADS 0.17±0.04 2.92±0.19＊＊CYP71AV1 0.05±0.02 0.13±0.03＊＊CPR 1.58±0.25 2.95±0.29＊＊

表3 4℃處理對青蒿萜類合成基因表達的影響（±s，n＝6）Tab3 Effects of 4℃treatment on transcriptional expressions of terpenoids biosynthetic gene（±s，n＝6）

表3 4℃處理對青蒿萜類合成基因表達的影響（±s，n＝6）Tab3 Effects of 4℃treatment on transcriptional expressions of terpenoids biosynthetic gene（±s，n＝6）

與25℃對照比較：＊P＜0.01vs.25 ℃ controls：＊P＜0.01

溫度/℃25 4基因mRNA拷貝數(shù)/actin mRNA拷貝數(shù)EPS 0.31±0.14 1.21±0.39＊SQS 0.51±0.06 0.54±0.18 CS 0.68±0.19 0.03±0.01＊FS 0.29±0.05 0.32±0.05

3 討論

植物的大多數(shù)生理生化過程都有ROS的產(chǎn)生。一般認為ROS是一種有害的氧代謝中間物，是引起細胞結(jié)構(gòu)和功能損傷的主要因素；但同時ROS也是一種普遍存在的信號分子，參與植物的防御反應(yīng)、基因表達調(diào)控等。Wallaart TE等[2，7]從黃花蒿中檢測到雙氫青蒿酸及其氫過氧化物，首次提出雙氫青蒿酸可能充當ROS清除劑的假設(shè)，并認為雙氫青蒿酸可能通過參與氧自由基催化的非酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化成青蒿素。雙氫青蒿酸等青蒿素合成前體在黃花蒿中的含量相對較為豐富，但進一步的過氧化反應(yīng)似乎成為青蒿素合成的瓶頸，而1O2等ROS在此過程中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在黃花蒿褐變的老葉中檢測到1O2濃度暴發(fā)式增長，同時青蒿素前體轉(zhuǎn)化成青蒿素的速度加快，青蒿素產(chǎn)量提高[8，9]。一些人工模擬的脅迫條件，如高濃度鹽和重金屬[10]、寡糖誘激子[11]等也同樣可以通過促進ROS生成而有利于青蒿素的積累。在本研究中，經(jīng)過4℃低溫處理后，黃花蒿中1O2和H2O2濃度逐漸上升，但48 h后伴隨著CAT活性和青蒿素含量的提高，濃度開始下降。Pu GB等[4]用水楊酸處理黃花蒿發(fā)現(xiàn)H2O2和超氧陰離子濃度在4 h迅速升高，促使雙氫青蒿酸向青蒿素轉(zhuǎn)化，而后隨著青蒿素含量的逐漸上升而逐步下降，與本研究結(jié)果相符，揭示ROS可能作為信號分子促進青蒿素的轉(zhuǎn)化。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過低溫處理后青蒿素合成相關(guān)基因的表達普遍上調(diào)，尤其是編碼青蒿素特異合成途徑的第一個關(guān)鍵限速酶——ADS的基因表達上升幅度最大。本課題組在以往的研究中也發(fā)現(xiàn)4℃處理黃花蒿苗30 min后，ADS、CYP71AV1和CPR的表達量上調(diào)，但上調(diào)幅度不如作用24 h高[12]。在蛋白表達水平上也證實，經(jīng)過冷誘導(dǎo)后，ADS與CYP71AV1這兩個酶的濃度分別上升50%和80%[13]。用水楊酸處理黃花蒿同樣也可見ADS和HMGR表達量提高，而青蒿酸、雙氫青蒿酸和青蒿素含量也相應(yīng)提高[4]?？梢?，低溫脅迫可通過直接誘導(dǎo)青蒿素合成相關(guān)基因表達而促進青蒿素合成。在黃花蒿中，以FPP為底物可以在不同的萜類合酶的作用下開始不同的萜類合成，調(diào)控這些萜類合酶的表達，比如過量表達ADS基因，同時抑制與青蒿素合成競爭底物的酶的基因表達，這對于增加青蒿素生物合成途徑的代謝流量、促進青蒿素合成有積極的意義。本課題組利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法將反義SQS整合于黃花蒿基因組，通過表達反義SQS來阻遏SQS表達，減少類固醇合成途徑對底物FPP的競爭性利用，獲得了高產(chǎn)青蒿素的轉(zhuǎn)基因株，其SQS表達水平最高下降90%，ADS表達水平為原來的3倍，表明在壓力作用下萜類合成的代謝流量會發(fā)生變化[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件一方面可促進青蒿素合成途徑ADS的表達；另一方面可抑制青蒿素合成競爭途徑CS基因的表達，以改變代謝流方向。

綜上，短暫的低溫刺激可能通過以下途徑提高青蒿素的合成：（1）產(chǎn)生高濃度ROS促進青蒿素合成前體的轉(zhuǎn)化；（2）誘導(dǎo)青蒿素合成相關(guān)基因尤其是特異酶基因表達，促進青蒿素前體合成；（3）刺激青蒿素生物合成途徑，抑制競爭途徑，藉此增加青蒿素合成途徑的代謝流量。本研究結(jié)果對于今后利用氧化脅迫條件提高青蒿素產(chǎn)量有重要意義。

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