馮碧敏，葉 云，陳麗娟（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，瀘州市 646000）

鹽酸多柔比星（Doxorubicin，DOX）是目前臨床常用的抗腫瘤藥物，臨床上用于白血病、淋巴瘤等的治療，效果顯著，但有骨髓抑制、心臟毒性等不良反應(yīng)。得力生注射液是斑蝥、蟾酥、人參、黃芪的全成分提取液，是我國第一個(gè)獲得國家二類新藥證書的復(fù)方抗癌中藥注射劑，具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的效應(yīng)，并具有止痛和提高免疫功能的作用；與抗腫瘤藥物聯(lián)用時(shí)，能夠保護(hù)骨髓細(xì)胞免受化療藥物損傷[1]。本文旨在研究鹽酸多柔比星與得力生注射液聯(lián)合用藥后對大鼠的藥動學(xué)影響，為進(jìn)一步減輕鹽酸多柔比星心臟毒性、骨髓毒性及促進(jìn)其合理用藥提供參考和數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DIONEX Ultimate3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；Kromasystem2000色譜工作站（Bio.Tek Instrument Snl）；TGL16型臺式高速冷凍離心機(jī)（長沙英泰儀器公司）；AE240電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；YKH-Ⅲ型液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠）；pHS-3C型酸度計(jì)（成都方舟科技開發(fā)公司）。

1.2 試藥

鹽酸多柔比星注射液（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：091001，規(guī)格：10 mg/支）；得力生注射液（北京正邦制藥有限公司，批號：080207，規(guī)格：10 mL/支）；鹽酸多柔比星對照品（批號：130509-200301）、柔紅霉素對照品（批號：130559-200501）均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇（色譜純，批號：10071753）、乙腈（色譜純，批號：10071743）均購自Honeywell Burdick Jackson；水為重蒸餾水，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物

SD大鼠16只，♀♂兼半，體重（200±20）g，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2008-17號）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（pH4.65）-冰醋酸（30∶20∶0.1），經(jīng)超聲清洗器脫氣30 min；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；紫外檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 鹽酸多柔比星對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸多柔比星對照品8.46 mg（97.4%），置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得329.6 mg·L-1的鹽酸多柔比星對照品貯備液，并將其稀釋配成鹽酸多柔比星濃度為0.206、0.515、1.03、2.06、6.87、10.3、20.6 mg·L-1的系列溶液。4 ℃貯藏，備用。

2.2.2 柔紅霉素內(nèi)標(biāo)溶液（IS）的制備 精密稱取柔紅霉素對照品2.53 mg（91%），置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得92.1 mg·L-1的柔紅霉素對照品內(nèi)標(biāo)貯備液，并稀釋為3.68 mg·L-1濃度的內(nèi)標(biāo)液。4℃貯藏，備用。

2.3 血清樣品的處理

精密量取血清樣品100 μL，置于10 mL試管內(nèi)，加入甲醇100 μL、3.68 mg·L-1IS 100 μL、乙酸乙酯1.0 mL，渦旋混合 5 min，5 000 r·min-1離心10 min，移取有機(jī)層于尖底離心管中，置30℃水浴中用空氣流揮干，殘?jiān)?0 μL甲醇溶解，渦旋2 min，取上清液20 μL進(jìn)樣。

2.4 給藥方法和樣本采集

2.4.1 分組和給藥 將SD大鼠隨機(jī)均分為2組，即Ⅰ組（鹽酸多柔比星注射液單用組，單用組）、Ⅱ組（鹽酸多柔比星與得力生注射液聯(lián)合用藥組，聯(lián)用組）。根據(jù)臨床用藥劑量反推大鼠劑量，Ⅰ組：給予鹽酸多柔比星注射液6 mg·kg-1；Ⅱ組：給予得力生注射液6.0 mL·kg-1，0.5 h后給予鹽酸多柔比星6 mg·kg-1，iv給藥。

2.4.2 血清樣品采集 于iv鹽酸多柔比星后0.083、0.167、0.5、1、3、6、12、24 h時(shí)間點(diǎn)采血0.2 mL。取血后血樣靜置30 min，3 000 r·min-1離心15 min，分取血清，于低溫冰箱－20℃存放，待測血藥濃度。按“2.3”項(xiàng)下方法操作，測定血藥濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和藥動學(xué)分析

測得的血液濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)用中國藥理學(xué)會編制的DAS（Drug And Statistics ver 2.1.1）藥動學(xué)程序擬合，并計(jì)算主要的藥動學(xué)參數(shù)；各藥動學(xué)參數(shù)采用SPSS 14.0軟件，用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 HPLC的方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 在選定色譜條件下，鹽酸多柔比星與內(nèi)標(biāo)峰峰形良好，分離完全，空白血清在鹽酸多柔比星、內(nèi)標(biāo)柔紅霉素的保留時(shí)間（分別為6.45、11.30 min）處無雜峰出現(xiàn)。血清HPLC見圖1。

圖1 血清HPLC圖A.空白血清；B.空白血清＋鹽酸多柔比星＋內(nèi)標(biāo)；C.血清樣品；1.鹽酸多柔比星；2.內(nèi)標(biāo)（柔紅霉素）Fig1 HPLC chromatograms of serumA.blank serum；B.blank serum+doxorubicin hydrochloride+internal standard；C.serum sample；1.doxorubicin hydrochloride；2.internal standard（daunorubicin）

以測定的樣品峰高與內(nèi)標(biāo)峰高的比值（Y）為縱坐標(biāo)，鹽酸多柔比星濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.342 9X+0.268 5（r＝0.998 0）。結(jié)果表明，鹽酸多柔比星檢測濃度在0.206～20.600 mg·L-1范圍內(nèi)同樣品峰高與內(nèi)標(biāo)峰高的比值線性關(guān)系良好。

3.1.2 加樣回收率試驗(yàn) 于空白大鼠血清中分別加入高、中、低濃度的鹽酸多柔比星對照品溶液，照“2.3”項(xiàng)下方法操作，3種濃度平行操作5次，測定，以測得量與加入量之比計(jì)算空白加樣回收率，結(jié)果見表1。

3.1.3 精密度試驗(yàn) 于空白大鼠血清中，分別加入低、中、高濃度的鹽酸多柔比星對照品溶液，照“2.3”項(xiàng)下方法操作，每種濃度樣品平行配制5份，在1 d內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)測定，進(jìn)行日內(nèi)精密度考察；在1周內(nèi)不同日期測定，進(jìn)行日間精密度考察，結(jié)果見表1。

表1 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab1 Results of recovery and precision test（±s，n＝5）

表1 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab1 Results of recovery and precision test（±s，n＝5）

理論值/mg·L-1測得值/mg·L-1 x 0.486±0.021 5.210±0.113 10.570±0.379/%RSD/%4.41 2.16 3.59回收率/%94.4 101.2 102.6日間精密度測得值/mg·L-1 0.524±0.024 5.204±0.141 10.076±0.2220.515 5.150 10.300 99.4 RSD/%4.55 2.81 2.20日內(nèi)精密度測得值/mg·L-1 0.493±0.027 5.132±0.174 10.162±0.336 RSD/%5.40 3.40 3.31

3.2 藥動學(xué)研究

單用、合用鹽酸多柔比星藥動學(xué)參數(shù)見表2；鹽酸多柔比星單用與合用平均藥-時(shí)曲線見圖2。

表2 單用、合用鹽酸多柔比星藥動學(xué)參數(shù)（±s，n＝5）Tab2 Pharmacokinetic parameters of doxorubicin hydrochloride alone or combined with other drug（±s，n＝5）

表2 單用、合用鹽酸多柔比星藥動學(xué)參數(shù)（±s，n＝5）Tab2 Pharmacokinetic parameters of doxorubicin hydrochloride alone or combined with other drug（±s，n＝5）

參數(shù) 單位t1/2α t1/2β h h Vl C L AUC（0-t）AUC（0-∞）Cmax L·kg-1 L·kg·h-1 mg·h·L-1 mg·h·L-1 mg·L-1單用組0.258±0.029 30.213±5.259 0.346±0.032 0.082±0.027 37.684±3.872 81.867±29.656 15.360±1.503聯(lián)用組0.266±0.003 35.243±2.590 0.573±0.084 0.143±0.044 23.252±3.651 46.791±18.063 9.593±1.495

圖2 鹽酸多柔比星單用與合用的平均藥-時(shí)曲線A.單用組；B.聯(lián)用組Fig2 Serum concentration-time curves of doxorubicin hydrochloride alone and combined with other drugsA.Stilamin group；B.Coupled group

4 討論

文獻(xiàn)[2，3]采用HPLC法檢測鹽酸多柔比星血藥濃度。由于鹽酸多柔比星與抗凝劑會發(fā)生反應(yīng)從而會影響其濃度的測定，故筆者在本研究中采用了血清樣本。在血清預(yù)處理時(shí)選擇乙醚、乙酸乙酯和三氯甲烷作為提取溶劑進(jìn)行比較，結(jié)果三氯甲烷的提取回收率較高，但毒性較大，且易乳化；乙醚揮發(fā)性較大，容易受溫度影響，故最后選擇乙酸乙酯作為提取溶劑，回收率較令人滿意，測定結(jié)果穩(wěn)定可靠，且靈敏度可以達(dá)到要求。

目前有關(guān)鹽酸多柔比星的臨床藥動學(xué)和藥效學(xué)的研究多以單一藥物為主[4～7]，而與其他藥物尤其是中藥聯(lián)合應(yīng)用的藥動學(xué)研究國內(nèi)鮮有報(bào)道。筆者首次將得力生注射液與鹽酸多柔比星聯(lián)合應(yīng)用，研究中藥對鹽酸多柔比星藥動學(xué)參數(shù)的影響，由藥動學(xué)數(shù)據(jù)推測：得力生注射液與鹽酸多柔比星聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，鹽酸多柔比星的AUC降低了35.08%，最大達(dá)峰時(shí)間（Cmax）降低了37.8%，消除半衰期（t1/2β）延長了16.6%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明得力生注射液可影響鹽酸多柔比星的吸收參數(shù)。筆者認(rèn)為可能是藥物促進(jìn)了血液循環(huán)，使表觀分布容積變大，鹽酸多柔比星較多地向組織轉(zhuǎn)運(yùn)，使得血藥濃度變低、AUC變小、t1/2β延長，同時(shí)也可能減少了藥物的毒副作用。

目前，在腫瘤治療過程中，中西藥物聯(lián)用的情況越來越普遍，它具有增強(qiáng)患者體質(zhì)，提高患者對手術(shù)、放療、化療等的耐受力，減輕各種治療的毒副反應(yīng)，提高生存質(zhì)量，延長生存期，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)等作用，成為腫瘤綜合治療的重要而獨(dú)特的手段之一。因此，研究聯(lián)合用藥時(shí)，藥動學(xué)參數(shù)的變化可以考慮是傳統(tǒng)用藥可能引起的毒性反應(yīng)以及聯(lián)合用藥時(shí)產(chǎn)生的藥物相互作用，這對于調(diào)整臨床用藥方案、提高治療效果、減少不良反應(yīng)、實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥具有極其重要的意義。

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