劉葉蔓，謝果珍（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙市 410208）

粗毛牛膝Achyranthes bindentataBL.是莧科多年生草本植物。其根、種子、莖和葉中含有蛻皮甾酮、土牛膝皂苷、生物堿等。藥理研究表明，其不同溶劑提取物在強(qiáng)心、抗生育、抗菌和癌細(xì)胞凋亡等方面有明顯的影響[1]。植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展為藥用植物有效成分的工廠化生產(chǎn)提供了一條有效的途徑。近年來，關(guān)于懷牛膝、川牛膝組織培養(yǎng)方面的研究已有報道[2～4]，但至今仍無粗毛牛膝在組織培養(yǎng)方面的報道。因此，筆者對粗毛牛膝的組織培養(yǎng)進(jìn)行了初步研究，并獲得了再生植株。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AF1004型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱（中新醫(yī)療儀器有限公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州三興凈化科技有限公司）。

1.2 試藥

基本培養(yǎng)基、萘乙酸（NAA）、6-芐基嘌呤（6-BA）均由上海艾研生物科技有限公司提供。

1.3 外植體

以粗毛牛膝帶腋芽的嫩莖為外植體。

2 方法

2.1 外植體及處理

外植體經(jīng)流水沖洗30 min、洗衣粉液浸洗5 min、清水清洗后，在超凈工作臺用75%的酒精振蕩浸潤2 min，用無菌水清洗4次，再用0.1%氯化汞消毒15 min，最后用無菌水清洗5次后接種在培養(yǎng)基上。

2.2 培養(yǎng)基及激素配比

選用L9（34）正交設(shè)計，根據(jù)試驗(yàn)號分別考察基本培養(yǎng)基（A）、NAA濃度（B）和6-BA濃度（C）3個因素對莖段和腋芽生長的影響。每個試驗(yàn)號重復(fù)20次，每瓶接種4塊，40 d后統(tǒng)計分析結(jié)果。計算公式：腋芽生長系數(shù)＝腋芽長度（cm）總和/（接種塊數(shù)－感菌塊數(shù)）。因素水平見表1。

表1 因素水平Tab1 Factors and levels

2.3 根的誘導(dǎo)

切取生長的腋芽尖端1.5 cm左右接種在1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上。

2.4 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)溫度均為（25±1）℃，1 500 lx光照12 h·d-1，12 h·d-1黑暗。培養(yǎng)基中均含3%蔗糖、0.65%瓊脂。pH 5.5～5.8。

3 結(jié)果

3.1 基本培養(yǎng)基及激素配比對莖段和腋芽生長的影響

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表2、表3結(jié)果表明，影響因素順序是A＞C＞B。A因素（基本培養(yǎng)基）和C因素（6-BA濃度）對腋芽生長各水平之間具有顯著意義，B因素（NAA濃度）沒有顯著性意義。結(jié)合實(shí)際，最佳培養(yǎng)基組合是A1B1C2，即以MS為基本培養(yǎng)基，添加0.1 mg·L-1NAA和0.5 mg-1L-16-BA，有利于腋芽的萌發(fā)和生長。因A1B1C2在正交表找不到，故應(yīng)作驗(yàn)證試驗(yàn)。

3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)A1B1C2配比配制培養(yǎng)基，其他條件同“2.4”項(xiàng)下，接種20瓶，每瓶接種塊數(shù)4塊，40 d統(tǒng)計結(jié)果，可得腋芽生長系數(shù)達(dá)10.210，比表2中最高者（字列號1）還高，表明A1B1C2為最佳培養(yǎng)基組合。

3.3 生根情況

以1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)基能有效誘導(dǎo)已萌發(fā)腋芽的生根，根的數(shù)量均在10條以上，生長健壯。

4 討論

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab3 Results of variance analysis

筆者考察基本培養(yǎng)基、NAA濃度和6-BA濃度不同配比對粗毛牛膝帶腋芽莖段生長的影響。結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基MS、6-BA濃度對腋芽的生長有顯著影響，最佳的培養(yǎng)基組合為MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA，這與文獻(xiàn)[5]對川牛膝的研究結(jié)果一致。通過驗(yàn)證試驗(yàn)可知，在NAA濃度為0.1 mg·L-1時，適當(dāng)增加6-BA的濃度，有利于腋芽的生長。在7號試驗(yàn)中，當(dāng)6-BA達(dá)到1.0 mg·L-1時，腋芽生長系數(shù)明顯降低。說明在一定濃度范圍內(nèi)，較高的6-BA/NAA比值有利于芽的分化和生長，這與文獻(xiàn)[6]研究結(jié)果一致：在其他因子不變的情況下，細(xì)胞分裂素所含濃度越高，叢生芽啟動越快，數(shù)量也較多，由此看來細(xì)胞分裂素對誘導(dǎo)粗毛牛膝外植體脫分化有關(guān)鍵作用。本研究中，不定芽在1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上100%生根，且幼根生長健壯，說明粗毛牛膝不定芽誘導(dǎo)生根能力強(qiáng)。本研究結(jié)果可為粗毛牛膝的生物技術(shù)利用提供理論依據(jù)。

[1]蔡光先.湖南藥物志[M].長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2004：79.

[2]李明軍，于相麗，陳明霞，等.懷牛膝愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生[J].植物生理學(xué)通訊，2004，40（3）：343.

[3]張麗萍，董誠明，金蓋宇.懷牛膝組織培養(yǎng)及齊墩果酸定量分析的研究[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，7（4）：32.

[4]李明軍，李 萍，洪森榮，等.懷牛膝愈傷組織誘導(dǎo)及分化的研究[J].河南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，33（4）：118.

[5]劉 堅(jiān)，張 挺，陳德茜，等.川牛膝組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J].中藥材，2006，29（5）：425.

[6]蔣澤平，梁珍海，李 勁，等.雜交鵝掌楸的離體培養(yǎng)和植株再生研究[J].江蘇林業(yè)科技，2004，31（6）：5.