萬(wàn)朝雷，魏玲，方藝霖，黃萍，沈素芳，章超（.江西九江市第一人民醫(yī)院藥劑科，九江市33000；.四川樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)所，樂(lè)山市 64000）

膽香鼻炎片為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)收載品種（YBZ20252005），由豬膽汁膏、廣藿香、白芷等9味中藥制備而成，具有消炎清熱、祛風(fēng)散寒、通竅止痛的功效，主要用于慢性單純性鼻炎和過(guò)敏性鼻炎的治療。組方中主藥豬膽汁膏所含的豬去氧膽酸（Hyodeoxycholic acid）具有降血脂、鎮(zhèn)痙、抑菌等作用[1]，是處方中的主要有效成分，但原標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)該成分的含量測(cè)定項(xiàng)目。由于豬去氧膽酸結(jié)構(gòu)中沒(méi)有紫外吸收基團(tuán)，如能夠在紫外檢測(cè)器中檢測(cè)必須經(jīng)過(guò)衍生化，因此本文以1-溴乙?；鶎?duì)硝基苯為衍生化試劑、18-冠醚-6為催化劑，采用柱前衍生化反相高效液相色譜（RP-HPLC）法對(duì)膽香鼻炎片中豬去氧膽酸含量進(jìn)行測(cè)定，建立了較為完善的測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

2695型HPLC儀、2487紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；XS205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

豬去氧膽酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：10087-200610）；膽香鼻炎片（吉林省大峻藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20090808、20091003、20091216）；乙腈（上海陸都化學(xué)試劑廠，色譜純）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取豬去氧膽酸對(duì)照品10.51 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。再精密量取對(duì)照品貯備液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的制備

取膽香鼻炎片樣品，除去糖衣，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱(chēng)定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。取續(xù)濾液2 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

取處方量藥材（不加入豬膽汁膏），按供試品溶液制備方法制得缺豬去氧膽酸的陰性對(duì)照溶液。

2.3 樣品的衍生化

精密量取供試品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，加氫氧化鉀溶液500 μL，水浴蒸干，放冷，加18-冠醚-6和1-溴乙?；鶎?duì)硝基苯試液各500 μL，密塞，放入60℃烘箱中加熱60 min，取出，冷卻至室溫，加乙腈定容至5 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μ m）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：乙腈-水（60∶40）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理后進(jìn)樣。結(jié)果，供試品色譜圖中有與對(duì)照品色譜圖中豬去氧膽酸峰相對(duì)應(yīng)的色譜峰，且該峰與其他峰的分離度＞1.5，理論板數(shù)為8 700，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.豬去氧膽酸對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照Fig1 HPLC chromatogramsA.hyodeoxycholic acid control；B.test sample；C.negative control

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取豬去氧膽酸對(duì)照品貯備液0.5、1、2、4、8、10 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理后，各吸取10 μL注入液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝20 259X－13 167（r＝0.999 4，n＝6）。結(jié)果表明，豬去氧膽酸檢測(cè)濃度在5.255～105.100 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

取豬去氧膽酸對(duì)照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理后，吸取10 μL注入液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，所得峰面積平均值為423 263，RSD＝1.5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取膽香鼻炎片樣品適量，共6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理后，分別吸取10 μL注入液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，所得峰面積平均值為443 268，RSD＝1.8%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取經(jīng)衍生化處理后的供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定豬去氧膽酸的峰面積。結(jié)果，RSD＝1.0%（n＝6），表明經(jīng)衍生化后的供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定，能滿(mǎn)足含量測(cè)定要求。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取同一膽香鼻炎片樣品（批號(hào)：20091003）約0.5 g，精密稱(chēng)定，共6份，分別加入豬去氧膽酸對(duì)照品適量，混勻，按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

2.11 樣品含量測(cè)定

取3批膽香鼻炎片樣品（批號(hào)：20090808、20091003、20091216）各適量，精密稱(chēng)定，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理后照上述色譜條件測(cè)定，代入回歸方程計(jì)算樣品含量。結(jié)果，3批樣品中豬去氧膽酸的含量依次為8.5、8.3、9.0 mg·g-1。

3 討論

筆者參考文獻(xiàn)方法[2～4]分別考察了衍生化試劑和催化劑的加入量（100、200、500、1 000 μL）、加入比例（1∶1、1∶2、2∶1）、反應(yīng)時(shí)間（30、40、60、120 min）和反應(yīng)溫度（40、50、60、80 ℃）等條件，確定當(dāng)衍生化試劑和催化劑加入量為500 μL、加入比例為1∶1、反應(yīng)時(shí)間為60 min、反應(yīng)溫度為60℃時(shí)，反應(yīng)最為充分。且該方法快速、準(zhǔn)確，衍生化后的供試品溶液穩(wěn)定，被測(cè)定溶液濃度與峰面積積分值有較好的線性關(guān)系，可作為膽香鼻炎片中豬去氧膽酸含量的測(cè)定方法，并可為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：299.

[2]楊學(xué)軍，仇麗穎，鐘米娜，等.RP-HPLC柱前衍生化測(cè)定熊去氧膽酸的含量[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，33（4）：821.

[3]暴梅佳，黎王翠，謝慶鳳，等.柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定清開(kāi)消炎片中豬去氧膽酸的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21（2）：186.

[4]陳文瓊，余敏靈，陳文秋，等.柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定法半夏中γ-氨基丁酸的含量[J].中國(guó)藥房，2008，19（12）：929.