杜兆香，鞠建峰（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南市 250011）

正交試驗(yàn)優(yōu)選鹽酸川芎嗪脂質(zhì)體的制備工藝

杜兆香＊，鞠建峰（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南市 250011）

目的：優(yōu)選鹽酸川芎嗪脂質(zhì)體的制備工藝。方法：以乙醚注入法制備川芎嗪脂質(zhì)體，采用正交試驗(yàn)，以包封率為指標(biāo)，以藥物與大豆卵磷脂用量比、PBS緩沖液的pH值、膽固醇與大豆卵磷脂用量比、乙醚與PBS緩沖液用量比為考察因素，優(yōu)選制備工藝。結(jié)果：最佳工藝條件為藥物∶大豆卵磷脂為1∶12，PBS緩沖液pH為7.5，膽固醇∶大豆卵磷脂為1∶2，乙醚∶PBS緩沖液為1∶2。結(jié)論：該制備工藝可行、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

鹽酸川芎嗪；脂質(zhì)體；正交試驗(yàn)；制備工藝

川芎嗪是從川芎中提取的有效成分四甲基吡嗪的鹽類，是川芎根莖中的主要活性生物堿?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，川芎嗪是一種新型鈣離子拮抗劑，具有活血化瘀、抗血小板凝集、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等作用，臨床用于心絞痛、腦血管以及肺動(dòng)脈高壓等呼吸系統(tǒng)疾病的治療[1～3]。鹽酸川芎嗪脂質(zhì)體通過(guò)鼻黏膜給藥，直接吸收進(jìn)入體內(nèi)，通過(guò)血-腦脊液屏障，具有藥物吸收快、顯效迅速、作用時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)。本研究在單因素考察的基礎(chǔ)上，以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)，對(duì)鹽酸川芎嗪脂質(zhì)體的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 儀器與試藥

LC-10ATVP-ODS高效液相色譜儀、SPD-10Avp紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；FA-1140電子天平（上海天平儀器廠）；5200H超聲振蕩器（上?？茘u超聲儀器有限公司）；82-5B磁力加熱攪拌器（南通科學(xué)儀器廠）；UV-2102PCS紫外-可見(jiàn)分光光度儀（上海尤尼柯儀器公司）；pHS-2C精密酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；G-50Sephadex凝膠柱（上海化學(xué)試劑廠）。

鹽酸川芎嗪對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0817-9803）；鹽酸川芎嗪原料（北京市燕京制藥廠，批號(hào)：020502）；大豆卵磷脂（EPC，上海源聚生物制品有限公司進(jìn)口分裝）；膽固醇（上海源聚生物制品有限公司）；空白脂質(zhì)體（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院自制）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)

選擇鹽酸川芎嗪為模型藥物，EPC、膽固醇為基本成膜材料，采用乙醚注入法制備鹽酸川芎嗪脂質(zhì)體。以制劑的形態(tài)、均勻性、放置是否分層、包封率等為主要指標(biāo)考察其工藝。

2.1.1 磷酸鹽緩沖液（PBS）pH值的影響 本試驗(yàn)考察了pH值分別為4.0、5.0、6.0、6.5、6.8、7.2、7.6、8.0的一系列PBS對(duì)脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，在pH低于6.5的PBS中不能制成脂質(zhì)體或制得的鹽酸川芎嗪脂質(zhì)體穩(wěn)定性較差，室溫靜置數(shù)天內(nèi)，即有分層或沉淀等現(xiàn)象產(chǎn)生。

2.1.2 EPC用量的影響 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在一定的藥物治療濃度下，隨著EPC濃度的增加，藥物的包封率也有所提高；但EPC用量過(guò)大時(shí)，水化完全較困難，又易發(fā)生凝聚現(xiàn)象，在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)較多的磷脂塊，分散不夠好。兼顧包封率和穩(wěn)定性，藥物與EPC用量的比在1∶8～1∶12范圍內(nèi)較好。

2.1.3 膽固醇用量的影響 膽固醇是脂質(zhì)體類脂膜的重要組成部分，具有調(diào)節(jié)流動(dòng)性及穩(wěn)定脂質(zhì)雙分子膜的功能[4]，對(duì)脂質(zhì)體膜的通透性具有雙向調(diào)節(jié)作用[5]。用量適當(dāng)，能使脂質(zhì)體膜的剛性增強(qiáng)，曲率半徑減少，包封率和穩(wěn)定性提高；用量過(guò)大，使脂質(zhì)體膜剛性過(guò)強(qiáng)，容易破裂，導(dǎo)致藥物滲漏；用量過(guò)少，使膜的流動(dòng)性增加，影響藥物釋放。參考有關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，膽固醇與EPC的用量比在1∶2～1∶7范圍內(nèi)較好。

2.1.4 PBS用量的影響 預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PBS用量較大時(shí)，水化困難，超聲時(shí)間較長(zhǎng)，制備的脂質(zhì)體粒徑較大。

2.1.5 水化方法的影響 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于電磁振蕩速度快，水化均勻，因此用電磁振蕩器進(jìn)行水化比超聲波水化所需時(shí)間短，且粒徑小，故采用電磁振蕩進(jìn)行水化。

2.1.6 水化溫度的影響 預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水化溫度過(guò)高所制備的脂質(zhì)體粒徑分布不均，而且溫度過(guò)高，EPC容易氧化，故選擇25℃作為水化時(shí)所用溫度。

2.2 制備工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素考察結(jié)果，把藥物與EPC的用量比（A）、PBS的pH值（B）、膽固醇與EPC的用量比（C）、乙醚與PBS的用量比（D）作為4個(gè)考察因素，以乙醚注入法制備川芎嗪脂質(zhì)體。因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平Tab 1 Factor and levels

2.3 包封率的測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：SHIMADZU VP-ODS（150mm×4.6mm，10μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（45∶55）；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：292nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取鹽酸川芎嗪對(duì)照品0.008g，用生理鹽水定容至25mL量瓶中，分別量取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mL，置于5mL量瓶中，加入生理鹽水定容，制得濃度分別為6.4、19.2、32.0、44.8、57.6μg·mL-1的對(duì)照品溶液。分別取上述溶液20μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以峰面積積分值（Y）為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.0053X－12.259（r＝0.9999，n＝5）。結(jié)果表明，鹽酸川芎嗪的進(jìn)樣量在6.4～57.6μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 凝膠柱分離測(cè)定脂質(zhì)體中游離藥物濃度 吸取一定量的脂質(zhì)體，上樣于已用生理鹽水平衡好的G-50Sephadex柱（1.0cm×20cm）上，用生理鹽水洗脫，流速為0.5mL·min-1，分次收集洗脫液，每次1.0mL，通過(guò)觀察流動(dòng)池內(nèi)溶液吸光度的變化監(jiān)測(cè)脂質(zhì)體與藥物的分離情況。收集游離藥物于50mL量瓶中，定容，取溶液適量經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算藥物濃度。

2.3.4 脂質(zhì)體包封率的計(jì)算 包封率是脂質(zhì)體的一個(gè)重要質(zhì)量指標(biāo)，一般可以用重量包封率（Qw）、體積包封率（Qv）或藥脂包封比（Ew）來(lái)表示。本試驗(yàn)采用Qw來(lái)表示，即單位體積包入脂質(zhì)體內(nèi)的藥物量（總藥量－游離藥物量，W包封）與總藥量（W總）的比值，可用下式計(jì)算：Qw（%）＝W包封/W總×100%。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

按表1中的安排制備9份樣品，照“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定包封率，平行測(cè)定3次，以包封率總和（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選工藝。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2；方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表2、表3可知，各因素均對(duì)川芎嗪脂質(zhì)體包封率有顯著性影響，其影響大小依次為B＞A＞D＞C，最佳處方組合為A3B3C1D1，即在pH7.5的PBS中，選用藥物∶EPC為1∶12、膽固醇∶EPC為1∶2、乙醚∶PBS為1∶2的比例制備脂質(zhì)體。

2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)化處方制備3批鹽酸川芎嗪脂質(zhì)體，照“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定包封率。結(jié)果，3批樣品的包封率分別為75.56%、77.73%、76.19%，均在理論預(yù)測(cè)范圍之內(nèi)，表明優(yōu)化的處方重現(xiàn)性好，其包封率穩(wěn)定。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Result of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Result of analysis of variance

3 討論

在脂質(zhì)體制備過(guò)程中，影響最終產(chǎn)品質(zhì)量的因素較多[6]，本文根據(jù)單因素考察，發(fā)現(xiàn)影響脂質(zhì)體制備的主要因素有EPC和膽固醇含量、有機(jī)相與水相體積比、藥物量和緩沖液pH值。在此基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化脂質(zhì)體的制備工藝，充分考察了4個(gè)因素不同水平對(duì)藥物包封率的影響，從數(shù)據(jù)處理的結(jié)果來(lái)看，優(yōu)化的制備條件重現(xiàn)性好、包封率高、穩(wěn)定性好。

[1] 胡國(guó)芬，王建平.川芎嗪的藥理作用及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)藥物與臨床，2006，6（10）：773.

[2] 梁愛(ài)群.川芎嗪的藥理及機(jī)理研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16（6）：532.

[3] 劉永明，李桂芝，張 慧，等.鹽酸川芎嗪的熒光光譜研究及應(yīng)用[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2001，18（4）：536.

[4] 趙榮生，侯新樸，嚴(yán)寶霞.脂質(zhì)體載體材料卵磷脂的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2001，18（1）：39.

[5] 王聞珠.酮洛芬脂質(zhì)體噴霧劑的研究[D].沈陽(yáng)：沈陽(yáng)藥科大學(xué)，2001.

[6] 張儉儉，孫曉東.新型脂質(zhì)體的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2007，18（31）：2465.

Optimization of the Preparation Technology of Ligustrazine Hydrochloride Liposome by Orthogonal Design

DU Zhao-xiang，JU Jian-feng（The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，China）

OBJECTIVE：To optimize the preparation technology of ligustrazine hydrochloride liposome.METHODS：The liposomes were prepared by ether injection method.The preparation technology was optimized by orthogonal design with encapsulation coefficency as index using ratio of drugs to soybean lecithin，pH value of PBS buffer solution，ratio of cholesterol to soybean lecithin and ratio of diethyl ether to buffer solution as factors.RESULTS：The ideal preparation technology was as follows：drug∶soybean lecithin＝1∶12，pH values of PBS was 7.5，cholestrol∶soybean lecithin＝1∶2，diethyl ether∶PBS buffer solution＝1∶2.CONCLUTION：The preparation technology is feasible，stable and reproducible and it serves as theoretic basis of industrial production.KEY WORDS Ligustrazine hydrochloride；Liposome；Orthogonal design；Preparation technology

R284.2；R283.69

A

1001-0408（2011）35-3303-02

＊副主任藥師。研究方向：藥物制劑新技術(shù)。電話：0531-68617919。E-mail：tsunping@163.com

2011-06-15

2011-07-22）