霍雙枝,施 萍,龐希寧

中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1細(xì)胞生物學(xué)衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究室 2附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)教研室,沈陽 110001

皮膚作為一種特殊的器官,是機(jī)體免于脫水、損傷和感染的第一道防線,也是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和阻止微生物、化學(xué)物質(zhì)等侵入的屏障。人羊膜 (human amniotic membrane,HAM)是一種天然高分子生物材料,含膠原、糖蛋白、蛋白多糖等多種成分,能表達(dá)多種生長(zhǎng)因子,有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖,促進(jìn)上皮和新生血管形成,抑制炎癥,促進(jìn)組織修復(fù)。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞 (human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)具有高度自我更新能力,易在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增,遺傳性狀穩(wěn)定,免疫原性低等特點(diǎn),存在于羊膜基質(zhì)中,在羊膜治療皮膚創(chuàng)傷時(shí)是直接接觸創(chuàng)面的細(xì)胞成分,但其在羊膜治療皮膚創(chuàng)傷中發(fā)揮的作用尚不十分清楚。本研究觀察了HAM負(fù)載hAMSCs對(duì)SD大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響,初步探討了羊膜治療皮膚創(chuàng)傷的機(jī)制。

材料和方法

材料和試劑 雄性SD大鼠18只,體重200～240 g,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部;包埋劑 (optimal cutting temperature compound,OCT)購(gòu)自美國(guó)McCormick公司,SABC免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自上海Maixin-Bio公司,角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,其他常規(guī)試劑購(gòu)自沈陽化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站。

羊膜的制備與負(fù)載 取健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的羊膜,其乙型肝炎5項(xiàng)、人類丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、梅毒等其他相關(guān)傳染性指標(biāo)均呈陰性。在無菌超凈臺(tái)上用PBS液沖洗羊膜上的血跡,鈍性分離羊膜,將其置于含1000 U/ml慶大霉素 +2.5μg/ml兩性霉素B的生理鹽水中浸泡20 min[1];將上述制備的羊膜用無菌棉線在其基質(zhì)面打結(jié)作辨認(rèn)標(biāo)記,然后用終濃度2.5 g/L胰蛋白酶于37℃培養(yǎng)箱中消化30 min,去上皮細(xì)胞;將消化后的羊膜用PBS反復(fù)沖洗,基質(zhì)面向上剪成合適大小鋪于自制玻片上,用細(xì)胞刮刀反復(fù)刮去殘留上皮細(xì)胞,放入培養(yǎng)皿中;將hAMSCs以1.54×105/cm2密度種于羊膜上,加入4 ml培養(yǎng)液培養(yǎng)[2]。

CFDA-SE染色 用DMSO制備1 mmol/L CFSE溶液,然后用PBS將其稀釋成 10 ～50μmol/L;將1/10細(xì)胞培養(yǎng)基體積的CFSE溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中,在37℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞15 min,用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次,加入DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)[3]。

創(chuàng)傷模型制備及分組 18只SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)3 d后,經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉,剃去背中部毛,在兩側(cè)相同部位做2 cm×2 cm創(chuàng)面,深至皮下,形成機(jī)械損傷動(dòng)物模型;每只SD大鼠的兩個(gè)創(chuàng)面做相同處理,18只SD大鼠隨機(jī)分為3組,每組6只:(1)對(duì)照組:在鼠背部傷口每日消毒;(2)單純羊膜組:在鼠背部傷口外敷單純羊膜;(3)HAM負(fù)載hAMSCs組:在鼠背部傷口外敷負(fù)載細(xì)胞的羊膜。

創(chuàng)面愈合觀察及指標(biāo)

大體情況觀察:術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng),每天觀察其健康、進(jìn)食、創(chuàng)面變化、肉芽組織生長(zhǎng)和創(chuàng)面愈合等情況。

創(chuàng)面愈合率測(cè)定:于創(chuàng)傷后每天用直尺測(cè)量創(chuàng)面面積,計(jì)算創(chuàng)面愈合率[4]。

HE染色:術(shù)后7、14、21 d,活檢創(chuàng)緣與正常交界處組織,制成6μm的冰凍切片,行HE染色。

免疫組織化學(xué)染色:采用SP法對(duì)各組鼠皮膚切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異比較行t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

負(fù)載羊膜的hAMSC CFDA-SE染色 標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光,形態(tài)良好,增殖能力不受影響 (圖1)。

各組大鼠創(chuàng)面愈合情況 所有大鼠均存活,活動(dòng)自如,進(jìn)食正常,未見便血和血尿,體重有所增加。創(chuàng)面呈漸進(jìn)性愈合,毛發(fā)沿創(chuàng)周隨面積的縮小而逐漸生長(zhǎng)。術(shù)后3 d,HAM負(fù)載hAMSCs組大鼠的傷口開始收縮且出現(xiàn)少許紅暈,其他兩組大鼠傷口濕潤(rùn);術(shù)后7 d,HAM負(fù)載hAMSCs組大鼠創(chuàng)緣皮膚收縮明顯,傷口干燥、無感染,創(chuàng)面已基本為肉芽組織所填充,其他兩組大鼠羊膜傷口濕潤(rùn)、有滲出,僅見薄層肉芽;術(shù)后14 d,HAM負(fù)載hAMSCs組大鼠傷口基本愈合,其他兩組大鼠傷口愈合欠佳;術(shù)后21 d,HAM負(fù)載hAMSCs組和單純羊膜組大鼠的創(chuàng)面愈合,HAM負(fù)載hAMSCs組的瘢痕小于單純羊膜組,對(duì)照組創(chuàng)面未完全愈合 (圖2)。對(duì)照組、單純羊膜組和HAM負(fù)載hAMSCs組大鼠創(chuàng)面的平均愈合時(shí)間分別為 (26.4±0.7)、(21.5±1.2)、 (18.3±0.9)d,其中HAM負(fù)載hAMSCs組愈合時(shí)間明顯短于對(duì)照組 (P＜0.01)和單純羊膜組 (P＜0.05),單純羊膜組明顯短于對(duì)照組 (P＜0.05)。

各組大鼠創(chuàng)面愈合率的比較 術(shù)后11 d和14 d,HAM負(fù)載hAMSCs組大鼠的創(chuàng)面愈合率分別為(81.5±7.2)%和 (94.3±3.6)%,明顯高于對(duì)照組的 (48.5±3.2)%和 (74.3±4.3)%及單純羊膜組的(68.5 ±4.5)%和 (86.8±4.8)%(P均 ＜0.01),單純羊膜組的創(chuàng)面愈合率則明顯高于對(duì)照組 (P均 ＜0.05);術(shù)后18 d,單純羊膜組大鼠的創(chuàng)面愈合率為(97.0±4.2)%,明顯高于對(duì)照組的 (87.5±5.1)%(P ＜0.05)(表1)。

HE染色結(jié)果 術(shù)后7 d,對(duì)照組可見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn);單純羊膜組可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肉芽組織中的新生血管含量少;HAM負(fù)載hAMSCs組可見肉芽組織中新生血管的數(shù)量明顯多于單純羊膜組。術(shù)后14 d,對(duì)照組可見新生血管增多,炎性細(xì)胞減少;單純羊膜組肉芽組織生長(zhǎng)旺盛;HAM負(fù)載hAMSCs組可見肉芽組織的毛細(xì)血管含量豐富,膠原沉積,組織結(jié)構(gòu)完整。術(shù)后21 d,對(duì)照組肉芽組織和毛細(xì)血管含量豐富,膠原沉積;單純羊膜組組織結(jié)構(gòu)完整,膠原束變得明顯;HAM負(fù)載hAMSCs組膠原纖維排列緊密,真皮內(nèi)有大量血管生成,且新生血管管腔較前明顯擴(kuò)大、管壁增厚 (圖3)。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 CK19多呈棕黃色顆粒沉淀于表皮基底層,皮脂腺和毛囊隆突部周圍 (圖4),術(shù)后14 d,HAM負(fù)載hAMSCs組大鼠皮膚CK19陽性表皮干細(xì)胞數(shù)為48.2±3.2,明顯高于單純羊膜組的37.7±3.1(P＜0.05)和對(duì)照組的29.6±2.4(P＜0.01);VEGF多呈棕黃色顆粒沉淀于真皮層細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中 (圖5),VEGF在各組均持續(xù)表達(dá)陽性,HAM負(fù)載hAMSCs組大鼠皮膚的VEGF陽性顆粒表達(dá)數(shù)為64.5±4.5,明顯高于單純羊膜組的52.6±3.8(P＜0.05)和對(duì)照組的40.7±3.1(P ＜0.01)。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率的比較 (n=6,,%)Table 1 Comparison of the wound healing rates at different time points among different groups(n=6,,%)

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率的比較 (n=6,,%)Table 1 Comparison of the wound healing rates at different time points among different groups(n=6,,%)

A組:對(duì)照組;B組:單純羊膜組;C組:HAM負(fù)載hAMSCs組;與A組比較,aP＜0.05;與C組比較,bP＜0.01Group A:blank control group;Group B:amniotic membrane group;Group C:human amniotic membrane load with human amniotic mesenchymal stem cells group;aP ＜0.05 compared with Group A;bP ＜0.01 compared with Group C

分組Group 3d 7d 11d 14d 18d 21d 26d A組 Group A 2.0±0.2 13.2±2.3 48.5±3.2b 74.3±4.3b 87.5±5.1 93.5±5.3 100 B組 Group B 4.5±0.3 20.3±2.7 68.5±4.5ab 86.8±4.8ab 97.0±4.2a 100 100 C組 Group C 6.5±0.5 29.8±2.8 81.5±7.2 94.3±3.6 100 100 100

討 論

隨著組織工程學(xué)和干細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展,細(xì)胞療法已成為治療創(chuàng)傷的新策略,其關(guān)鍵問題是尋找合適的種子細(xì)胞[5]。理想的種子細(xì)胞應(yīng)具備以下條件:可靠的細(xì)胞來源,容易獲得,體外可快速擴(kuò)增培養(yǎng)。本研究中,經(jīng)胰酶處理后的HAM仍為膜片狀,有韌性,便于貼覆創(chuàng)面。將 hAMSCs負(fù)載HAM上,細(xì)胞易于黏附,生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)良好,在創(chuàng)面修復(fù)過程中不形成異常結(jié)構(gòu),因此,HAM是負(fù)載細(xì)胞理想的生物材料。此外,本研究結(jié)果顯示,HAM負(fù)載hAMSCs組大鼠創(chuàng)面的愈合速度明顯快于單純羊膜組和對(duì)照組,提示hAMSCs可縮短皮膚損傷愈合時(shí)間,促進(jìn)損傷皮膚的修復(fù)。

創(chuàng)傷組織的修復(fù)是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過程,主要經(jīng)過炎癥期、增殖期、組織重構(gòu)3個(gè)階段[6]。隨炎性滲出后,逐漸出現(xiàn)成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。隨著肉芽形成,創(chuàng)緣表皮的新生上皮向創(chuàng)面中心推進(jìn),填補(bǔ)創(chuàng)口,逐漸覆蓋創(chuàng)面,最終愈合[7]。本研究組織學(xué)結(jié)果顯示,HAM負(fù)載hAMSCs修復(fù)創(chuàng)面可使炎性細(xì)胞減少,肉芽組織生長(zhǎng)旺盛,表皮生長(zhǎng)規(guī)整,組織結(jié)構(gòu)完整,證實(shí)hAMSCs是通過促進(jìn)正常的表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管再生,促進(jìn)皮膚損傷愈合。

CK19是表皮干細(xì)胞特異標(biāo)記物,主要分布于表皮基底層,皮脂腺和毛囊隆突部周圍[8]。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的促血管生成細(xì)胞生長(zhǎng)因子,能促使微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,有利于新生血管生長(zhǎng)[9]。本研究結(jié)果顯示,HAM負(fù)載hAMSCs組大鼠的CK19陽性細(xì)胞數(shù)和VEGF表達(dá)均明顯高于單純羊膜組和對(duì)照組,提示hAMSCs可能是通過促進(jìn)表皮干細(xì)胞和毛細(xì)血管的再生,促進(jìn)創(chuàng)傷組織的愈合。

綜上,HAM負(fù)載hAMSCs明顯縮短了皮膚損傷愈合時(shí)間,使表皮生長(zhǎng)規(guī)整、較厚,成纖維細(xì)胞排列規(guī)整,新生毛細(xì)血管含量豐富,并提高了CK19陽性細(xì)胞數(shù)量,上調(diào)了VEGF的表達(dá),表明hAMSCs可加強(qiáng)HAM對(duì)皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)作用,并證實(shí)hAMSCs是通過促進(jìn)正常的表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管再生,促進(jìn)損傷皮膚的修復(fù)。但hAMSCs是如何促進(jìn)皮膚表皮干細(xì)胞和毛細(xì)血管再生的,還需進(jìn)一步研究。

圖1 hAMSCs CFDA-SE染色呈綠色熒光 (×400)Fig 1 The staining of hAMSCs CFDA-SE shows green fluorescence(×400)

圖2 各組大鼠創(chuàng)面愈合變化情況Fig 2 Changes of wound healing in three groups

圖3 各組不同時(shí)間大鼠創(chuàng)面HE染色 (×10)Fig 3 HE staining of the wound at different time points among different groups(×10)

圖4 各組不同時(shí)間大鼠創(chuàng)面角蛋白19免疫組織化學(xué)染色 (×40)Fig 4 Cytokeratin 19 immunohistochemical staining of the wound at different time points among different groups(×40)

圖5 各組不同時(shí)間大鼠創(chuàng)面血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子免疫組織化學(xué)染色 (×40)Fig 5 Vascular endothelial growth factor immunohistochemical staining of the wound at different time points among different groups(×40)

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