周建華,康 寧,崔蓮仙,何 維

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)系,北京 100005

治療惡性腫瘤的傳統(tǒng)手段有手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療。然而,手術(shù)治療不能清除腫瘤的微轉(zhuǎn)移灶,難以取得根治性療效;放療具有劑量依賴性毒性,無(wú)法有效清除潛在的轉(zhuǎn)移灶,且部分患者因產(chǎn)生放射抵抗而對(duì)放療不敏感;化療易引起全身免疫抑制,且部分患者因化療藥物無(wú)法有效進(jìn)入腫瘤組織或?qū)熕幬锂a(chǎn)生耐藥性而影響療效。隨著對(duì)免疫學(xué)和腫瘤學(xué)研究的不斷深入,人們提出了生物治療的概念,其中過(guò)繼細(xì)胞免疫治療成為近年來(lái)免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。γ δ T細(xì)胞能夠以主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)非限制性方式識(shí)別腫瘤抗原,通過(guò)穿孔素和顆粒酶等途徑殺傷腫瘤細(xì)胞,還與其他固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞相互作用,輔助其發(fā)揮抗腫瘤作用[2-4]。因此,γ δ T細(xì)胞在腫瘤免疫細(xì)胞治療中是一種具有優(yōu)勢(shì)的候選細(xì)胞[5-6]。為了有效擴(kuò)增人外周血 γ δ T細(xì)胞以滿足臨床過(guò)繼免疫治療的需要,本研究在原有固相抗體體外擴(kuò)增法的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了培養(yǎng)基的比較和選擇。

材料和方法

材料 人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞Daudi購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心,使用添加10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);人外周血單個(gè)核細(xì)胞 (peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分離自健康志愿者外周血,樣本采集符合中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會(huì)的要求。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津TBD生物技術(shù)公司,重組人白細(xì)胞介素2(interleukin 2,IL-2)購(gòu)自北京瑞得合通藥業(yè)有限公司,佛波酯 (phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)、離子霉素 Ionomycin為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,布雷菲德菌素 (Brefeldin A,BFA)購(gòu)自美國(guó) eBioscience公司 ,純化抗人 TCR γ δ抗體、FITC 標(biāo)記的抗人T細(xì)胞受體 (T cell receptor,TCR)γ δ單克隆抗體、PE標(biāo)記的抗人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)抗體、 CD107a抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司,RPMI-1640培養(yǎng)基、AIM-V培養(yǎng)基和OpTmizer培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Cyto-Tox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司,細(xì)胞內(nèi)染色的試劑盒Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeabilization Kit購(gòu)自美國(guó)BD公司。RPMI-1640/AIM-V/OpTmizer完全培養(yǎng)基為含1%自體血清、200 U/ml IL-2、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基,細(xì)胞毒檢測(cè)用培養(yǎng)基為含10%小牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640。

人外周血來(lái)源 γ δ T細(xì)胞的培養(yǎng) 抗凝人外周血以淋巴細(xì)胞分離液分離,得到的PBMC分別重懸于RPMI-1640/AIM-V/OpTmizer無(wú)血清培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基 , 以 500μl(1μg/ml) 抗人 TCRγ δ單克隆抗體固相包被24孔培養(yǎng)板進(jìn)行刺激,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2周。γ δ T細(xì)胞體外擴(kuò)增效率的計(jì)算:

擴(kuò)增效率 =(培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù) ×γ δ T細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)比例)/(PBMC總數(shù) ×γ δ T細(xì)胞占PBMC比例)

臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè) γ δ T細(xì)胞的存活率 細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色后,在顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù)外周4個(gè)大格中總細(xì)胞數(shù)和著藍(lán)色的死細(xì)胞數(shù):

細(xì)胞存活率 =(總細(xì)胞數(shù)-死細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100%

免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) γ δ T細(xì)胞的純度和表型 收集約1×106個(gè)細(xì)胞,以含1%BSA的PBS洗液洗滌2次。加入適量熒光標(biāo)記抗體,4℃避光孵育20 min。PBS洗液洗滌 2次,重懸于200μl含1%多聚甲醛的PBS固定液中,用于流式細(xì)胞儀分析。

免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) γ δ T細(xì)胞表達(dá)的殺傷相關(guān)分子和分泌的細(xì)胞因子 采用細(xì)胞毒檢測(cè)用培養(yǎng)基重懸 γ δ T細(xì)胞至1×106個(gè)細(xì)胞/ml,加入20 ng/ml PMA和 0.5μg/ml Ionomycin;如檢測(cè)細(xì)胞因子,需要同時(shí)加入3μg/ml BFA。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2飽和濕環(huán)境孵育6 h;收集細(xì)胞,加入適量熒光標(biāo)記抗體,4℃避光孵育20 min;PBS洗液洗滌2次,用300μl細(xì)胞膜固定透化液重懸細(xì)胞,4℃孵育30 min～1 h;透化洗液洗2次,加入適量熒光標(biāo)記抗體,4℃避光孵育20 min;透化洗液洗滌細(xì)胞2次,重懸于200μl含1%多聚甲醛的PBS固定液中,用于流式細(xì)胞儀分析。

乳酸脫氫酶法檢測(cè) γ δ T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行:收集腫瘤細(xì)胞Daudi作為靶細(xì)胞,以培養(yǎng)2周的人外周血來(lái)源 γ δ T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞 ,效靶比 (E∶T)分別為0.1∶1、0.5∶1、1∶1。效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞混合后置于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 h,收集培養(yǎng)上清用于乳酸脫氫酶釋放量的測(cè)定。按照下列公式計(jì)算殺傷效率:

殺傷效率 =(實(shí)驗(yàn)孔值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔值)/(靶細(xì)胞最大釋放孔值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔值) ×100%

結(jié) 果

γ δ T細(xì)胞的存活率和純度比較 3種培養(yǎng)基添加自體血清培養(yǎng)的細(xì)胞存活率均略高于無(wú)血清培養(yǎng),其中RPMI-1640培養(yǎng)基添加血清與否對(duì)細(xì)胞的存活率影響最大,未添加血清的RPMI-1640培養(yǎng)基擴(kuò)增的細(xì)胞存活率隨培養(yǎng)時(shí)間增加而下降 (圖1)。

圖1 不同培養(yǎng)基條件下 γ δ T細(xì)胞存活率的比較Fig 1 Comparison ofthe survival rate of γ δ T cells cultured in different culture media

6種培養(yǎng)條件下擴(kuò)增達(dá)1周和2周時(shí),除未添加自體血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和AMI-V培養(yǎng)基外,其余培養(yǎng)條件下 γ δ T細(xì)胞的純度都逐漸增加;不論添加血清與否,AIM-V和OpTmizer培養(yǎng)基擴(kuò)增的細(xì)胞純度都明顯高于 RPMI-1640(P＜0.05或 P＜0.01)。第2周時(shí),添加血清的 AIM-V和OpTmizer培養(yǎng)基擴(kuò)增的細(xì)胞純度都顯著高于添加血清的RPMI-1640培養(yǎng)基 (P均 ＜0.05),但AIM-V和OpTmizer間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);未添加血清的OpTmizer培養(yǎng)基擴(kuò)增的細(xì)胞純度顯著高于RPMI-1640和AIM-V(P均 ＜0.05),添加血清與不添加血清的OpTmizer培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞的純度在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均 ＞0.05)(圖2)。

γ δ T細(xì)胞擴(kuò)增效率的比較 培養(yǎng)2周時(shí),未添加血清的OpTmizer培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增效率顯著高于RPMI-1640和AIM-V(P均 ＜0.05);添加血清的AIM-V培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增效率顯著高于RPMI-1640(P＜0.05),而添加血清的OpTmizer培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增效率顯著高于RPMI-1640(P＜0.01)和AIM-V(P＜0.05);同種培養(yǎng)基添加血清培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的擴(kuò)增效率均顯著高于不添加血清培養(yǎng)的細(xì)胞 (P＜0.05)(圖3)。

γ δ T細(xì)胞殺傷相關(guān)分子的表達(dá)及細(xì)胞因子的分泌 3種培養(yǎng)條件擴(kuò)增的 γ δ T細(xì)胞經(jīng)PMA/Ionomycin刺激后,表達(dá)殺傷相關(guān)分子CD107a及分泌細(xì)胞因子TNF-α的細(xì)胞比例都明顯增加 (P＜0.01),3種培養(yǎng)條件擴(kuò)增的細(xì)胞表達(dá)相同分子及分泌相同細(xì)胞因子的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(圖4)。

圖2 不同培養(yǎng)基條件下 γ δ T細(xì)胞純度的比較Fig 2 Comparison of purity of γ δ T cells cultured in different culture media

圖3 不同培養(yǎng)基條件下 γ δ T細(xì)胞擴(kuò)增效率的比較Fig 3 Comparison of the proliferation of γ δ T cells cultured in different culture media

圖4 擴(kuò)增 γ δ T細(xì)胞殺傷相關(guān)分子的表達(dá)及細(xì)胞因子的分泌Fig 4 Function-related molecule expression and cytokine release by expanded γ δ T cells

γ δ T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用比較 RPMI-1640培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)Daudi細(xì)胞的殺傷效率顯著低于OpTmizer和AIM-V培養(yǎng)的細(xì)胞 (P均 ＜0.05),OpT-mizer和AIM-V培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)Daudi細(xì)胞的殺傷效率差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(圖5)。

圖5 擴(kuò)增 γ δ T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞Daudi的細(xì)胞毒作用Fig 5 Cytotoxicity against Daudi cells by expanded γ δ T cells

討 論

在人類外周血中, γ δ T細(xì)胞約占CD3+T細(xì)胞的1%～10%。根據(jù)其表達(dá)V γ和Vδ功能區(qū)的不同,可將人類 γ δ T細(xì)胞分為不同亞群,其中外周血主要包含兩個(gè)亞群:(1)Vδ 2 T細(xì)胞:表達(dá) TCR可變區(qū)V γ 9 和 V δ 2 的細(xì)胞 亞群 , 在 外 周血 γ δ T 細(xì)胞中所占比例較高;(2)Vδ 1 T細(xì)胞:表達(dá)TCR可變區(qū) Vδ l的細(xì)胞亞群,主要定居于上皮組織中,在外周血 γ δ T細(xì)胞中所占比例較低[7]。盡管一直以來(lái),大家都認(rèn)為V δ 2 T細(xì)胞主要分布于外周血,對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤有較好的細(xì)胞毒作用,而Vδ 1 T細(xì)胞主要分布于上皮組織及上皮相關(guān)的淋巴組織中,對(duì)上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞有較好的細(xì)胞毒作用[5],但是,越來(lái)越多的證據(jù)顯示,V δ 1 T細(xì)胞在抗血液系統(tǒng)腫瘤的過(guò)程中同樣具有舉足輕重的作用[8]。

目前國(guó)際上用于過(guò)繼免疫治療的 γ δ T細(xì)胞主要來(lái)自磷酸抗原的體外擴(kuò)增,該方法擴(kuò)增的主要是V δ 2 亞型的 γ δ T 細(xì)胞[9]。 本課題 組前期 研究證實(shí) ,采用固相化抗 TCRγ δ單克隆抗體擴(kuò)增法可以使 γ δ T細(xì)胞得到大量擴(kuò)增,擴(kuò)增的 γ δ T細(xì)胞既包括 Vδ 2亞群,也包括Vδ 1亞群,并對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有明顯細(xì)胞毒作用[10]。這為固相化抗TCR γ δ單克隆抗體擴(kuò)增的 γ δ T細(xì)胞用于過(guò)繼免疫治療腫瘤提供了研究基礎(chǔ)。

為了使 γ δ T細(xì)胞的培養(yǎng)更簡(jiǎn)便 、更適合臨床過(guò)繼免疫治療的應(yīng)用,本研究采用了RPMI-1640、AIM-V和OpTmizer 3種培養(yǎng)基,其中,RPMI-1640是培養(yǎng)T細(xì)胞最常用的培養(yǎng)基,培養(yǎng)過(guò)程中需要添加一定比例的血清,以補(bǔ)充細(xì)胞生長(zhǎng)所需的一些未知的細(xì)胞因子,而常用作添加的牛血清因?yàn)槭钱惙N血清不能在臨床治療時(shí)使用。人AB血清或者自體血清可以作為牛血清的替代品,但是因?yàn)槠鋪?lái)源有限而限制了細(xì)胞制劑的規(guī)?；a(chǎn)。為此,對(duì)血清依賴性低的培養(yǎng)基成為臨床治療用細(xì)胞培養(yǎng)的首選。同樣廣泛應(yīng)用于T細(xì)胞培養(yǎng)的AIM-V培養(yǎng)基被稱為無(wú)血清培養(yǎng)基,而OpTmizer培養(yǎng)基是在AIM-V的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良的新型無(wú)血清培養(yǎng)基,內(nèi)含可以提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平[11]的N-乙酰-1-半胱氨酸,有利于細(xì)胞因子依賴的T細(xì)胞擴(kuò)增[12]。本研究比較了3種培養(yǎng)基分別在添加或不添加自體血清條件下對(duì) γ δ T細(xì)胞的擴(kuò)增能力,以及所擴(kuò)增的 γ δ T細(xì)胞的效應(yīng)功能。結(jié)果顯示,不添加血清的條件下,AIM-V和OpTmizer對(duì) γ δ T細(xì)胞的擴(kuò)增能力明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的RP-MI-1640培養(yǎng)基。添加1%自體血清后,3種培養(yǎng)基的擴(kuò)增效果都明顯增強(qiáng),但AIM-V和OpTmizer培養(yǎng)基仍然具有明顯優(yōu)勢(shì),特別是OpTmizer培養(yǎng)基擴(kuò)增γ δ T細(xì)胞的能力最佳,且對(duì)腫瘤細(xì)胞具有良好的細(xì)胞毒活性。這些結(jié)果表明,OpTmizer培養(yǎng)基對(duì)血清依賴性最低,擴(kuò)增的細(xì)胞具有良好的效應(yīng)功能,更適合臨床治療所需 γ δ T細(xì)胞制劑的大規(guī)模制備。

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