李彩虹,施 萍,龐希寧

中國醫(yī)科大學 1細胞生物學衛(wèi)生部重點實驗室干細胞與再生醫(yī)學研究室2附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學教研室,沈陽 110001

人羊膜間充質(zhì)干細胞 (human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)在羊膜中含量豐富,分化能力強,能在體外進行分離、培養(yǎng),且生物性能穩(wěn)定,可以為實驗和臨床提供充足的細胞來源。表皮生長因子 (epidermal growth factor,EGF)可與EGF受體 (epidermal growth factor receptor,EGFR)結(jié)合并激活EGFR信號通路,在促進細胞增殖、存活、遷移等方面發(fā)揮重要作用[1]。筆者以往研究發(fā)現(xiàn),EGF能促進hAMSCs的增殖和遷移[2]。

研究顯示,磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)家族參與了多種信號通路,通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控降低或促進其表達,可以調(diào)節(jié)細胞生理活動。Jak/STAT和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases,ERK)通路可調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡,對腸道病理生理過程起著重要的調(diào)控作用[3-5]。Sheng等[6]研究證實,ERK和PI3K/AKT信號通路在調(diào)節(jié)腸上皮細胞的生長、遷移、分化和凋亡中均發(fā)揮十分重要的作用。在多種病理生理過程中,PI3K/AKT和ERK通路之間可產(chǎn)生多樣的相互作用[7-8],兩者可協(xié)同調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡等病理生理過程[9-10]。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2,MMP-2)是降解細胞外基質(zhì)骨架蛋白Ⅳ型膠原的主要酶之一,主要參與傷口愈合等生理功能,在正常成人組織中水平較低,只有在系統(tǒng)接受一個刺激或病理狀態(tài)下才會升高。研究表明,腫瘤細胞侵襲過程中首先需要水解細胞外基質(zhì),多種腫瘤細胞的侵襲均伴隨MMP-2表達升高,EGF促進小鼠胚胎干細胞遷移時,MMP-2表達也有升高[11]。

轉(zhuǎn)錄組學研究是基因功能研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點,通過在整體水平研究基因的表達,揭示特定生物學過程以及疾病發(fā)生過程的分子機制,是連接基因組遺傳信息與蛋白質(zhì)組功能信息的必然紐帶[12]。目前關(guān)于細胞遷移機制的研究主要集中在具體某條信號通路上,缺少整體水平的研究。本研究觀察了EGF對體外培養(yǎng)hAMSCs遷移的影響,并在轉(zhuǎn)錄組水平上檢測了基因表達的差異,探討了EGF影響hAMSCs遷移的機制。

材料和方法

材料 DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco BRL公司,FBS購自美國Hyclone公司,Transwell小室購自美國Corning公司,EGF、AG1478、LY294002、U0126購自美國Sigma公司,磷酸化表皮生長因子 (phosphorylated Epidermal growth factor,P-EGFR)、磷酸化蛋白激酶B (phosphorylated protein kinase B,P-AKT)、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (phosphorylated extracellular regulated protein kinases,P-ERK1/2)、MMP-2 抗體購自美國Cellsignaling公司,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體購自中國Kangchen公司,山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、Trizol購自美國Invitrogen公司,RTPCR試劑盒、Realtime-PCR試劑盒購自大連Takara公司。

hAMSCs遷移能力的測定 采用帶有8μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室測定細胞的遷移能力,具體為:hAMSCs用無血清的DMEM/F12饑餓12 h,胰酶消化并用無血清培養(yǎng)基制成密度為2×105/ml的細胞懸液,然后分為對照組 (未處理)、EGF組、抑制劑AG1478+EGF組、抑制劑LY294002+EGF組和抑制劑U0126+EGF組5組;將100μl細胞懸液分別加入各孔上室,下室加入600μl含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基;培養(yǎng)24 h后取出小室,以棉簽拭去小室濾膜上的細胞,小室濾膜下的細胞于4%多聚甲醛中固定10 min,DAPI染色。由于DAPI能將細胞核染成藍色,1個細胞只有1個細胞核,所以通過計數(shù)藍色的細胞核數(shù)目就可以得到穿過膜的細胞數(shù)。在熒光顯微鏡下隨機取5個高倍視野,計數(shù)穿過濾膜的細胞數(shù)目,取平均值,實驗重復3次。

Western blot 取等量細胞總蛋白,用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用TBST[10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6),150 mmol/L NaCl,0.05%Tween-20]洗3次,然后用5%的脫脂奶粉封閉1 h,一抗雜交過夜,TBST洗3次,再用辣根過氧化物酶標記的二抗雜交1 h,TBST洗3次,最后用ECL plus(GE Healthcare)檢測。

Real-time PCR 采用ABI Prism 7500(美國ABI公司),用SYBR Green法進行檢測,每個樣品做3個副孔,以GAPDH做對照,具體為:用Trizol試劑提取細胞總RNA,以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用特異性引物做q-PCR,檢測基因的相對表達量。引物采用Primer 5設(shè)計,GAPDH上游引物5'-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC,下游引物5'-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A;MMP-2上游引物5'-CTC ATC GCA GAT GCC TGG AA,下游引物5'-CAG CCT AGC CAG TCG GAT TTG。

RNA-Seq技術(shù) 提取生物樣品的總 RNA,從中純化出mRNA;利用二價陽離子處理mRNA使其片段化,然后將片段化的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,構(gòu)成cDNA文庫,并用高保真聚合酶進行PCR擴增以富集所得到的cDNA文庫;利用Illumina Genome Analyzer平臺對得到的cDNA文庫進行測序,對測序數(shù)據(jù)進行生物信息學處理及后續(xù)分析。

統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用q檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

各組hAMSCs的遷移情況 對照組、EGF組、抑制劑AG1478+EGF組、抑制劑LY294002+EGF組和抑制劑U0126+EGF組穿過的細胞數(shù)目分別為41.13 ±2.862、60.33 ±5.482、35.73 ±0.8110、37.40±1.943和40.97±1.977,其中,EGF組是對照組的1.5倍 (P=0.0361),抑制劑AG1478+EGF組 (P=0.0113)、抑制劑 LY294002+EGF組 (P=0.0169)和抑制劑 U0126+EGF組 (P=0.0293)明顯低于對照組。

各組P-EGFR、P-AKT和P-ERK1/2的表達情況 Western blot檢測結(jié)果顯示,EGF處理10 min后,EGF組的P-EGFR、P-AKT和 P-ERK1/2表達水平增加;60 min后,P-EGFR恢復至原來的水平,P-AKT和P-ERK1/2仍低于原來的水平。抑制劑AG1478+EGF組的P-EGFR表達未見升高、P-AKT和P-ERK1/2表達也未升高。抑制劑LY294002+EGF組的P-AKT表達水平顯著下降,P-ERK表達水平較EGF組有所降低,但較對照組有所升高。抑制劑U0126+EGF組的P-ERK1/2顯著降低 (圖1)。

EGF作用后MMP-2的表達情況 Western blot檢測結(jié)果顯示,EGF作用24 h后,MMP-2蛋白表達水平升高,MMP-9表達沒有變化。Real-time PCR檢測結(jié)果,EGF處理12 h后,MMP-2 mRNA表達水平增高,之后下降 (圖2)。

差異表達基因的篩選情況 對EGF組和對照組細胞中差異表達基因的GO功能富集分析和KEGG代謝途徑分析結(jié)果表明,EGF組細胞中發(fā)生轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)修飾、凋亡抑制等生命過程,其中與MAPK信號通路有關(guān)的基因為DUSP5、IL1B、DUSP6、NGF和HSPA2。

討 論

圖1 各組P-EGFR、P-AKT和P-ERK1/2的表達情況Fig 1 Expressions of P-EGFR,P-AKT,and P-ERK1/2 in each group

圖2 EGF作用不同時間后MMP-2和MMP-9的變化情況Fig 2 Expressions of MMP-2 and MMP-9 after having been treated with EGF for different time

為了評估EGF作用于hAMSCs后對其遷移的影響以及其中可能涉及的信號通路,本研究首先采用Transwell小室檢測了不同處理條件下hAMSCs的遷移情況,此外還檢測了EGFR、AKT、ERK等信號分子的磷酸化水平,并采用AG1478、LY294002、U0126等一系列信號分子的抑制劑來進一步驗證各信號分子的活性受到抑制后對EGF作用所產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示EGF處理后hAMSCs遷移能力增強,并且PI3K/AKT通路中的AKT磷酸化水和ERK信號通路中的ERK1/2磷酸化水平增高。用EGFR的抑制劑AG1478作用后,EGFR、AKT、ERK1/2的磷酸化水平均下降;PI3K的抑制劑LY294002作用后,AKT和ERK1/2的磷酸化水平下降,細胞的遷移能力也下降。由此推測,EGF與EGFR構(gòu)成的信號通路可能是經(jīng)過PI3K、ERK等信號分子,進一步將遷移信號傳導致核內(nèi),引起基因轉(zhuǎn)錄,編碼細胞生長、細胞骨架變化所必需的蛋白質(zhì),促進細胞的遷移。

研究表明,基質(zhì)金屬蛋白酶,特別是MMP-2和MMP-9可通過降解細胞外基質(zhì)使得細胞-基質(zhì)和細胞-細胞間的連接降解,從而參與內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞的遷移[13]。干細胞與腫瘤細胞一樣,具有分化程度低的特點,兩者在一些基因調(diào)節(jié)方面也有相似之處。有研究證實,MMP-2的過表達與腫瘤侵襲程度密切相關(guān),小鼠胚胎干細胞中可表達MMP-2和MMP-9,但其表達是否與細胞的遷移有關(guān)目前尚不清楚[11]。本研究檢測了EGF作用不同時間后MMP-2和MMP-9的蛋白表達量,發(fā)現(xiàn)MMP-2在EGF作用24 h后顯著升高,MMP-9表達沒有變化;之后用Real-time PCR技術(shù)檢測EGF作用后MMP-2在mRNA水平的表達,發(fā)現(xiàn)EGF作用12 h后MMP-2表達增高;由此推測MMP-2可能參與了EGF對hAMSCs的調(diào)控,與細胞遷移有關(guān)。

鑒于單獨研究某條信號通路的局限性,本研究采用RNA-Seq技術(shù)對hAMSCs基因組、基因匹配情況進行了統(tǒng)計分析,并對EGF組和對照組差異表達基因進行GO功能富集分析,結(jié)果顯示EGF組細胞發(fā)生轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)修飾、抑制凋亡等生命過程,與MAPK信號通路有關(guān)的基因為DUSP5、IL1B、DUSP6、NGF和HSPA2。其中,DUSP5是一種雙特異性蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶,酪氨酸磷酸化在控制正常細胞的生長、分化、代謝、細胞周期、細胞-細胞通信、細胞遷移、基因轉(zhuǎn)錄、離子通道、免疫應(yīng)答及生存方面非常重要,因此DUSP5基因有望成為調(diào)節(jié)hAMSCs遷移的靶點。

綜上,本研究結(jié)果顯示,EGF可以促進體外培養(yǎng)hAMSCs的遷移,其可能是通過PI3K/AKT、ERK信號通路介導的,需要MMP-2的表達,及其參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)修飾和凋亡抑制等基因的協(xié)同表達。由于EGF在干細胞治療過程中可能通過促進有絲分裂、新生血管生成、抗炎、細胞保護、抗凋亡、調(diào)節(jié)免疫等旁分泌機制來發(fā)揮作用[14],因此可望在hAMSCs的臨床治療中發(fā)揮重要作用。

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