閆作梅，張 旭，李 杰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

里氏木霉作為工業(yè)菌株，常用來(lái)生產(chǎn)多種重要的酶類(lèi)，包括纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，具有巨大的商業(yè)價(jià)值[1-2]。目前，里氏木霉的基因組測(cè)序已經(jīng)完成，對(duì)于其基因的功能有待研究和開(kāi)發(fā)[3]。同時(shí)，里氏木霉是理想的表達(dá)真核基因的系統(tǒng)，具有很好的合成和分泌蛋白的能力，在理想的培養(yǎng)條件下發(fā)酵分泌纖維素酶可達(dá)到40～100 g·L-1發(fā)酵液[4-5]，被稱(chēng)為重組蛋白工廠。Harkki等報(bào)道，通過(guò)基因定位置換整合使編碼里氏木霉CBHI的基因失活，結(jié)果EGI的產(chǎn)量提高，不再產(chǎn)生CBHI；1993年，Karhunen等將編碼里氏木酶EGI的基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子CBHI的控制下，用此表達(dá)盒替換染色體的CBHI位點(diǎn)之后，EGI產(chǎn)量是通常強(qiáng)纖維素分解菌所產(chǎn)CBHI量的2倍或者與其一樣多；此外，還有一些關(guān)于里氏木酶的一個(gè)或幾個(gè)纖維素酶基因經(jīng)基因定位置換整合而失活的報(bào)道[6-7]。

在里氏木霉轉(zhuǎn)化研究中，常以營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因作為篩選標(biāo)記，這種篩選標(biāo)記易于篩選獲得轉(zhuǎn)化子，被廣泛應(yīng)用到絲狀真菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中[8]。其中乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶（ura3）基因缺陷株及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)己被證明是一種行之有效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。由于5-氟乳清酸（5-FOA）對(duì)原養(yǎng)型菌株有毒性作用，而ura3缺陷菌株則對(duì)其產(chǎn)生抗性，所以提供了一種可以正反雙向篩選的篩選系統(tǒng)。

本研究嘗試?yán)棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)法通過(guò)同源重組獲得里氏木霉ura3基因缺失突變體，從而為里氏木霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)條件

大腸桿菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)；里氏木霉菌種活化用土豆培養(yǎng)基，培養(yǎng)里氏木霉菌絲體用PDA培養(yǎng)基或MM培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

菌株：大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、里氏木霉QM9414。

質(zhì)粒：pEMT-5由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.3 分子試劑

膠回收試劑盒Gel Extract Kit（購(gòu)自百泰克公司）。限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、rTaq酶、LA-Taq酶 、 dNTP、 PyrobestTMDNA Polymerase、pMD18-T vector等（購(gòu)自大連寶（TaKaRa）生物工程有限公司）。

1.1.4 PCR引物設(shè)計(jì)

ura3引物序列如下：

pyrA引物序列如下：

ura3和pyrA基因農(nóng)桿菌PCR檢測(cè)引物序列：

1.2 方法

1.2.1 ura3和pyrA基因的克隆

以里氏木霉QM9414基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增ura3基因片段，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 469 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃延伸10 min，4℃保存，30個(gè)循環(huán)。

以黑曲霉UV48基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增pyrA基因片段，大小為3 370 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸4 min，72℃延伸10 min，4℃保存，30個(gè)循環(huán)。

1.2.2 ura3缺失基因載體和pyrA基因載體構(gòu)建

質(zhì)粒提取、酶切、轉(zhuǎn)化參見(jiàn)文獻(xiàn)[9]，連接參見(jiàn)文獻(xiàn)[10]，DNA片段回收參見(jiàn)膠回收試劑盒說(shuō)明。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌

取0.5～1 μL重組質(zhì)粒DNA，加入100 μL根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；冰浴5 min，液氮冷凍8 min，迅速至37℃溫浴融化；加入800 μL YEB液體培養(yǎng)基，28℃，輕輕搖動(dòng)4～5 h；

5 000 r·min-1離心5 min，倒掉大部分上清，將剩余約50 μL菌液用移液器轉(zhuǎn)至含有Km 100 mg·L-1、Gent 50 mg·L-1、Rif 50 mg·L-1的 YEB 固體培養(yǎng)基上涂勻。28℃暗培養(yǎng)48～96 h。

1.2.4 根癌農(nóng)桿菌和里氏木霉共培養(yǎng)

用5 mL滅菌蒸餾水從培養(yǎng)5～7 d的PDA平板上洗下里氏木霉菌的分生孢子，用MM液體培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)的孢子濃度。接種含雙元載體系統(tǒng)的pEMT-△ura3根瘤農(nóng)桿菌單菌落于3 mL液體YEB培養(yǎng)基（含 50 mg·L-1Rif、50 mg·L-1Gent、100 mg·L-1Kan）中，200 r·min-1，28 ℃培養(yǎng) 2～3 d，離心收集菌體，用一定體積的IM液體培養(yǎng)基重懸菌體。將菌液濃度調(diào)到660 nm處的吸收值為0.25，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，OD660達(dá)到0.6～0.8。取處理好的里氏木霉孢子懸液和根瘤農(nóng)桿菌菌液各100 μL，混勻，涂布MM 培養(yǎng)基（含 200 μmol·L-1乙酰丁香酮），24 ℃共培養(yǎng)48 h。

1.2.5 轉(zhuǎn)化子的篩選

將在24℃孵育48 h的培養(yǎng)物移至含有尿嘧啶核苷（1.87 mg·mL-1）、五氟乳氰酸（5 mg·mL-1）和阿莫西林（100 mg·mL-1）的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)8～10 d至抗性菌落出現(xiàn)。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子的鑒定

提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。如果ura3基因被敲除，擴(kuò)增出片段應(yīng)為445 bp；如果黑曲霉的pyrA插入到里氏木霉的基因組中，擴(kuò)增出650 bp的片段。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-FOA篩選濃度的確定

將里氏木霉孢子接種于含不同濃度5-FOA的PDA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d后，里氏木霉生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1。5-FOA濃度在5 mg·mL-1時(shí)即可有效抑制里氏木霉的生長(zhǎng)，因此確定5-FOA篩選濃度為 5 mg·mL-1。

圖1 5-FOA對(duì)里氏木霉生長(zhǎng)的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of 5-FOA on the germination and growth of Trichoderma reesei strains

2.2 ura3和pyrA基因的克隆

ura3基因PCR擴(kuò)增得到一條1 469 bp的目的條帶（見(jiàn)圖2）；pyrA基因PCR擴(kuò)增得到一條3 300 bp的目的條帶（見(jiàn)圖3）。將上述擴(kuò)增條帶克隆至T載體，篩選陽(yáng)性克隆送交測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，已獲得完整的ura3基因和pyrA基因片段（序列略）。

2.3 ura3缺陷型載體的構(gòu)建

ura3缺陷型載體pEMT-△ura3的構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖4。HindⅢ、XbaⅠ雙酶切質(zhì)粒pMD-ura3，回收約2 600和1 470 bp的片段。再將1 470 bp的小片段用SmaⅠ酶切，回收約650和700 bp片段。將上述3個(gè)片段連接，獲得質(zhì)粒pMD-△ura3。經(jīng)酶切和測(cè)序證明，該載體上的ura3基因缺失110 bp，結(jié)果正確。再用Eco RⅠ、NheⅠ雙酶切質(zhì)粒pEMT-5，回收約8 000 bp的載體片段，與經(jīng)同樣酶切質(zhì)粒pMD-△ura3回收的1 350 bp的目的片段連接，獲得載體pEMT-△ura3。通過(guò)凍融法將pEMT-△ura3轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖2 ura3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification of ura3

圖3 pyrA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Results of PCR amplification of pyrA

2.4 黑曲霉pyrA基因載體的構(gòu)建

黑曲霉pyrA基因載體pEMT-pyrA的構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖6，將pEMT-ku70載體用XbaⅠ、Sna BⅠ雙酶切，回收11 524 bp的載體片段，然后用XbaⅠ，NcoⅠ雙酶切的黑曲霉pyrA基因片段與載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEMT-pyrA。

圖4 pEMT-△ura3載體的構(gòu)建Fig.4 Construction of vector pEMT-△ura3

圖5 pEMT-△ura3轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的鑒定結(jié)果Fig.5 Characterization of pEMT-△ura3 transfer in Agrobacterium

圖6 pEMT-pyrA載體的構(gòu)建Fig.6 Construction of vector pEMT-pyrA

通過(guò)凍融法將pEMT-△ura3轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖7。

2.5 ura3基因缺失突變株的分子鑒定

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pEMT-△ura3轉(zhuǎn)化里氏木霉QM9414，將篩選平板上獲得的菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證（見(jiàn)圖 8）。

結(jié)果顯示隨機(jī)挑選的20個(gè)轉(zhuǎn)化子中只有1個(gè)可以擴(kuò)增得到ura3的缺失基因（445 bp，泳道13），即發(fā)生的是同源重組，將其命名為QM9414-△ura3突變株。還有5株（泳道3、7、9、10、12）同時(shí)擴(kuò)增出445和555 bp特異條帶，即發(fā)生的是非同源重組，其同源重組率為16.6%（1/6）。

圖7 pEMT-pyrA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的鑒定結(jié)果Fig.7 Characterization of pEMT-pyrA transfer in Agrobacterium

2.6 里氏木霉ura3基因缺失突變體的回復(fù)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pyrA基因轉(zhuǎn)化里氏木霉QM9414-△ura3突變株，在不含有尿嘧啶核苷酸的基本培養(yǎng)基平板上篩選回復(fù)突變株。然后應(yīng)用PCR篩選整合有pyrA基因的轉(zhuǎn)化子，在隨機(jī)挑取的30個(gè)轉(zhuǎn)化子中，有3個(gè)擴(kuò)增出目的基因（見(jiàn)圖9）。

圖8 △ura3基因缺失突變株的PCR檢測(cè)Fig.8 PCR detection of△ura3 gene disruptant

圖9 pyrA轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)Fig.9 PCR detection of pyrA gene

3 討論

目前，常用紫外誘變的方法對(duì)絲狀真菌的菌株進(jìn)行改造，但是不易控制誘變的位點(diǎn)。而同源重組利用DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)，通過(guò)載體DNA序列與靶細(xì)胞內(nèi)染色體上同源DNA序列間的重組從而定向改變細(xì)胞遺傳特性，具有明顯的優(yōu)勢(shì)[8]。

由于絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和選擇標(biāo)記被成功的應(yīng)用于許多的真菌轉(zhuǎn)化中，這就為人們?cè)诨蛩缴涎芯空婢倪z傳背景和菌株的改造提供了有利的條件，其中以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系備受關(guān)注[11-12]。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌轉(zhuǎn)化與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)[13-16]：①轉(zhuǎn)化效率高；②可導(dǎo)入大片段的DNA；③導(dǎo)入基因拷貝數(shù)低，表達(dá)效果好，穩(wěn)定遺傳；④農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法使用的技術(shù)、儀器簡(jiǎn)單；⑤同源重組效率高。Lima等利用傳統(tǒng)的PEG介導(dǎo)的方法對(duì)T.atroviride進(jìn)行轉(zhuǎn)化，同源重組的頻率很低，而利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了60%的同源重組的轉(zhuǎn)化子，使得其敲除基因的效率可達(dá)14%～75%，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)tmk1和tga3基因非編碼區(qū)的基因破壞[17]。

本試驗(yàn)全面考慮了高效基因修飾和置換技術(shù)的要點(diǎn)，有機(jī)整合了一些相關(guān)技術(shù)，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法提高里氏木霉的轉(zhuǎn)化效率，通過(guò)以u(píng)ra3作為篩選標(biāo)記降低了轉(zhuǎn)化子的假陽(yáng)性，提高導(dǎo)入DNA片段的同源重組效率。所建立的高效基因修飾和置換系統(tǒng)符合食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的要求，由此所研制的工程菌和重組蛋白具有高度的安全性，可用于食品加工，應(yīng)用領(lǐng)域更為廣闊。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將帶有△ura3基因的載體導(dǎo)入到里氏木霉宿主細(xì)胞內(nèi)，使載體上的△ura3基因與宿主細(xì)胞的染色體DNA發(fā)生同源重組，從而獲得以u(píng)ra3作為篩選標(biāo)記的營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株，同時(shí)證實(shí)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法能高效的敲除里氏木霉基因，為研究里氏木霉的功能基因提供了高效的、快速的方法。

4 結(jié)論

本研究從里氏木霉QM9414中克隆了ura3基因，構(gòu)建了ura3基因敲除載體pEMT-△ura3。從黑曲霉中克隆了pyrA基因，構(gòu)建了pyrA基因載體pEMT-pyrA。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ura3缺失基因轉(zhuǎn)化里氏木霉QM9414，篩選獲得QM9414-△ura3突變株，其同源重組率為16.6%。將pyrA基因轉(zhuǎn)化QM9414-△ura3突變株，篩選獲得回復(fù)突變株。

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