周瑞金，杜國(guó)強(qiáng)，師校欣

（1.河南科技學(xué)院園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北 保定 071001）

利用轉(zhuǎn)基因進(jìn)行作物改良開(kāi)辟了作物育種的新途徑，最大限度地繞過(guò)了物種間生殖隔離的障礙，使農(nóng)作物獲取整個(gè)生物界的遺傳資源，大大縮短了育種的周期，但其能否成功關(guān)鍵在于外源基因在轉(zhuǎn)化體內(nèi)的遺傳穩(wěn)定性和表達(dá)情況。

轉(zhuǎn)基因應(yīng)用的實(shí)踐表明，外源基因在受體中的命運(yùn)受到一系列生理生化過(guò)程的作用，并以復(fù)雜的遺傳方式表現(xiàn)出來(lái)，外源基因片段大小、甲基化、丟失、共抑制、基因沉默等都會(huì)影響其穩(wěn)定遺傳和表達(dá)[1－3]。

在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)材料繼代時(shí)間越長(zhǎng)遺傳變異率越高。經(jīng)過(guò)多代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因組培苗是否仍然保持原有品種的遺傳性狀，外源基因是否丟失，關(guān)系到轉(zhuǎn)基因苗離體保存是否安全的問(wèn)題。前人研究主要集中于普通組培苗繼代培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性[4－9]，對(duì)于轉(zhuǎn)基因組培苗在繼代培養(yǎng)過(guò)程中外源基因的穩(wěn)定性研究較少。本試驗(yàn)對(duì)繼代多代的轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果組培苗中目的基因和報(bào)告基因的遺傳和表達(dá)情況進(jìn)行研究，為轉(zhuǎn)基因作物離體的保存和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為蘋(píng)果（Malus domestica Borkh.）組培苗及轉(zhuǎn)豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（CpTI）蘋(píng)果組培苗，品種為皇家嘎拉（Royal Gala）、王林（Orin）、喬納金（Jonagold）和富士（Fuji），由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室培育。其中轉(zhuǎn)基因品種皇家嘎拉46個(gè)株系編號(hào)為1～46；王林9個(gè)株系編號(hào)為47～55；喬納金3個(gè)株系編號(hào)為56～58；富士2個(gè)株系編號(hào)為59～60。非轉(zhuǎn)基因品種有：嘎拉（CK1）；王林（CK2）；喬納金（CK3）；富士（CK4）。

轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果組培苗采用常溫繼代保存。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，光照時(shí)間16 h光照∶8 h黑暗，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。繼代培養(yǎng)基 MS+BA 0.5 mg·L－1+NAA 0.04 mg·L－1+白砂糖 30 g·L－1+瓊脂 6.0 g·L－1，pH 5.8～6.0。每 8 周繼代一次，培養(yǎng)保存6～8年。

1.2 方法

1.2.1 nptⅡ基因的檢測(cè)

取常規(guī)繼代培養(yǎng)6～8年的轉(zhuǎn)CpTI基因蘋(píng)果株系組培苗新梢，接入繼代培養(yǎng)基MS+BA 0.5 mg·L－1+NAA 0.04 mg·L－1+白砂糖 30 g·L－1+瓊脂 6.0 g·L－1+Kan50mg·L－1中，30d后觀察新梢生長(zhǎng)和白化情況。

1.2.2 外源CpTI基因的PCR檢測(cè)

參照杜國(guó)強(qiáng)等提取蘋(píng)果組培苗DNA的方法提取植物總DNA[10]，堿裂解法提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA[11]。PCR擴(kuò)增分別以被檢植物總DNA、陰性對(duì)照植物總DNA、陽(yáng)性對(duì)照（質(zhì)粒）DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。由CpTI基因序列設(shè)計(jì)引物1：5′GATGATGGTGCTAAAGGTGT 3′，引物 2：5′CTTACTCATCATCTTCATCC 3′。PCR 反應(yīng)體系：20 μL 體系中含 TaqDNA 聚合酶 1.5 U，dNTPs 0.3 mmol·L－1，上游引物和下游引物各 0.25 μmol·L－1，Mg2+2.25 mmol·L－1，模板 DNA 40 ng，1×PCR 緩沖液，加滅菌超純水使總體積為20 μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?4℃預(yù)變性6 min后，擴(kuò)增35次循環(huán)，每循環(huán)包括94℃變性60 s，56℃退火90 s，72℃延伸90 s，最后一循環(huán)后72℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)后，取各樣品反應(yīng)液5 μL，用1%的瓊脂糖在100 V·cm－1條件下電泳檢測(cè)，GD8000凝膠成像系統(tǒng)觀測(cè)結(jié)果并照相。

1.2.3 總RNA提取

蘋(píng)果組培苗總RNA提取用TRIzol一步法（大連TaKaRa公司），按試劑操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 mRNA反轉(zhuǎn)錄

按照Promega公司AMV mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 RT－PCR 分析

PCR 反應(yīng)體系：25 μL 反應(yīng)體系：3 μL 20×稀釋的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，1 μL 引物 1，1 μL 引物 2，2 μL 25 mmol·L－1dNTPs，1.5 μL 25 mmol·L－1Mg2+，5 U TaqDNA聚合酶，2.5 μL 10×PCR緩沖液。PCR擴(kuò)增條件：在94℃預(yù)變性2 min后，擴(kuò)增30次循環(huán)，每循環(huán)包括94℃變性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸100 s，最后一循環(huán)后72℃延伸10 min，4℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，用1%的瓊脂糖在100 V·cm－1條件下電泳檢測(cè)，GD8000凝膠成像系統(tǒng)觀測(cè)結(jié)果并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 nptⅡ基因的卡那霉素抗性檢測(cè)

nptⅡ標(biāo)記基因可使轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生對(duì)卡那霉素的抗性。蘋(píng)果組培苗新梢在含有50 mg·L－1卡那霉素的繼代培養(yǎng)基中生長(zhǎng)30 d后，未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照組培苗葉片全部白化，轉(zhuǎn)基因嘎拉、富士及喬納金組培苗全部生長(zhǎng)正常，未出現(xiàn)白化或花葉現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因王林中除轉(zhuǎn)化株系48和49表現(xiàn)出新生葉片花葉現(xiàn)象外，其他株系生長(zhǎng)正常（見(jiàn)圖1）。說(shuō)明標(biāo)記基因nptⅡ在嘎拉、富士和喬納金常規(guī)繼代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化株系中穩(wěn)定存在并可以正常表達(dá)；而王林2個(gè)轉(zhuǎn)化株系出現(xiàn)的花葉現(xiàn)象可能是因?yàn)閚ptⅡ酶表達(dá)量偏低所致。

2.2 外源CpTI基因的PCR檢測(cè)

采集繼代培養(yǎng)6～8年的轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果組培苗的60個(gè)株系葉片，測(cè)定外源CpTI基因的存在情況。以CpTI基因的一對(duì)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，從60個(gè)株系中均可以得到一條均一的條帶，片斷大小約309 bp，而以非轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果組培苗總DNA為模板擴(kuò)增，沒(méi)有檢測(cè)到該特征帶。

因此認(rèn)為轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果在組織培養(yǎng)條件下，常規(guī)繼代培養(yǎng)6～8年后，外源CpTI基因在轉(zhuǎn)基因植株中具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

2.3 RT-PCR檢測(cè)外源基因在蘋(píng)果組培苗中的表達(dá)

對(duì)外源CpTI基因在60個(gè)株系蘋(píng)果組培苗中的表達(dá)進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)，結(jié)果如下：48和49號(hào)2個(gè)株系沒(méi)有得到309 bp的特異性目的片段，42～47、52、55～59等15個(gè)株系得到的309 bp特異性目的片段亮度暗，其余43個(gè)株系得到的目的片段明亮。表明外源CpTI基因在2個(gè)株系中mRNA未表達(dá)，43個(gè)轉(zhuǎn)化株系中的mRNA水平表達(dá)強(qiáng)度較高，在其余轉(zhuǎn)化株系中表達(dá)強(qiáng)度較弱。部分株系的蘋(píng)果組培苗總RNA及RT－PCR電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2、3所示。

圖1 轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果苗在含50 mg·L-1卡那霉素培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Fig.1 Plant growth status of transgenic apple on medium containing 50 mg·L-1Kan

圖2 部分蘋(píng)果組培苗總RNA電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of total RNA in apple cultured in vitro

圖3 部分蘋(píng)果組培苗RT-PCR電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR in apple cultured in vitro

3 討論

果樹(shù)的遺傳背景十分復(fù)雜，其體細(xì)胞突變不僅發(fā)生在田間狀態(tài)，也廣泛存在于組織與細(xì)胞培養(yǎng)中。一般認(rèn)為變異頻率為1%～3%[12]，但也有表型變異率高達(dá)90%的報(bào)道[5]。這種變異的發(fā)生對(duì)于保存含有外源目的基因的轉(zhuǎn)化株系十分不利，可能會(huì)導(dǎo)致目的基因的沉默或丟失。前人研究表明，果樹(shù)組培苗遺傳穩(wěn)定性受基因型、繼代培養(yǎng)時(shí)期（繼代次數(shù)）、培養(yǎng)條件如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用等因素影響，如香蕉莖尖快繁后代存在一定比例的表現(xiàn)型變異，變異率隨繼代代數(shù)增加而增加，而杜國(guó)強(qiáng)等曾對(duì)不同繼代次數(shù)（3～90代）的富士、金冠和喬納金組培苗進(jìn)行分析，認(rèn)為其莖尖離體繼代培養(yǎng)90次以?xún)?nèi)具有較高的遺傳穩(wěn)定性[7]。本試驗(yàn)對(duì)常規(guī)繼代培養(yǎng)6～8年的60個(gè)蘋(píng)果轉(zhuǎn)化株系外源基因的檢測(cè)結(jié)果表明，外源基因在蘋(píng)果轉(zhuǎn)化組培苗中具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

在許多情況下，外源基因在受體植株中的表達(dá)很不穩(wěn)定，有的能正常表達(dá)，有的表達(dá)量很低甚至不表達(dá)，其表達(dá)與轉(zhuǎn)基因的失活和沉默有關(guān)。在矮牽牛轉(zhuǎn)苯基苯乙烯酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）基因轉(zhuǎn)化紫花矮牽牛以加深花色的研究中發(fā)現(xiàn)，高達(dá)42%的轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株產(chǎn)生白色或紫白相間的花朵，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因均被抑制，即基因不但沒(méi)有高效表達(dá)，反而影響了內(nèi)源基因的正常表達(dá)。在同一植物轉(zhuǎn)化事件中，發(fā)生外源基因沉默的轉(zhuǎn)化體占總數(shù)的3%～100%是一個(gè)較為普遍的現(xiàn)象[13]。本試驗(yàn)在卡那霉素抗性檢測(cè)中有2個(gè)株系表現(xiàn)花葉，結(jié)合mRNA檢測(cè)結(jié)果分析，造成這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)橥庠椿蚧騨ptⅡ酶表達(dá)量偏低所致。而外源基因表達(dá)差異的原因可能是由于外源基因整合位點(diǎn)不同、基因沉默或基因的甲基化等，關(guān)于外源基因在不同株系間表達(dá)的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在60個(gè)常規(guī)繼代培養(yǎng)6～8年的轉(zhuǎn)CpTI基因蘋(píng)果轉(zhuǎn)化株系中均可檢測(cè)出CpTI特異基因片段；除轉(zhuǎn)化株系48和49在50 mg·L-1卡那霉素濃度下出現(xiàn)花葉現(xiàn)象，表現(xiàn)缺乏卡那霉素抗性外，其他株系在含相同濃度卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)正常。對(duì)60個(gè)轉(zhuǎn)化株系蘋(píng)果組培苗進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)入的外源CpTI基因在43個(gè)轉(zhuǎn)化株系中得到了較高水平的表達(dá)，分別為轉(zhuǎn)化株系1～41、51和53；在42～47、52、55～59等15個(gè)轉(zhuǎn)化株系中表達(dá)強(qiáng)度低，在轉(zhuǎn)化株系48和49中未檢測(cè)到特異表達(dá)條帶。因此，轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果在組織培養(yǎng)條件下，常規(guī)繼代培養(yǎng)6～8年后，外源CpTI基因在轉(zhuǎn)基因植株中可穩(wěn)定存在，但外源基因表達(dá)不穩(wěn)定，在不同株系間存在一定差異。

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