李宇偉,連瑞麗,劉永錄,解克偉

(1.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校藥物工程系,河南 鄭州 450011;2.禹州市森源本草天然產(chǎn)物有限公司,河南 禹州 461670)

迷迭香又名油安草,具有清除自由基、消炎、抗病毒等多方面的功效,主要成分鼠尾草酸的抗病毒作用較強(qiáng)[1-2]。目前,提取迷迭香中的鼠尾草酸采用的方法主要有溶劑浸提法、勻漿法、回流法、超臨界提取法、超聲法等。我們經(jīng)多次試驗,超聲法相比其他方法更適合工廠化生產(chǎn)。國內(nèi)外對迷迭香中的鼠尾草酸的測定,主要采取液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和高效液相色譜法。高效液相色譜主要采用梯度洗脫法,分析時間長。我們采用高效液相色譜配合紫外檢測器,以乙腈-水為流動相,等度洗脫,鼠尾草酸在25 min左右出峰,且峰形良好,靈敏度高,重現(xiàn)性好,樣品譜圖中雜質(zhì)干擾較少,樣品中鼠尾草酸的峰形及與其他雜峰的分離度最為理想。本試驗以禹州市森源本草天然產(chǎn)物有限公司中藥GAP生產(chǎn)基地的不同采收期迷迭香葉片為材料,采用有機(jī)溶劑提取和分離其中的鼠尾草酸,建立了高效液相色譜法測定其含量,用此方法作為測定迷迭香中的鼠尾草酸的含量,非常適合于迷迭香的質(zhì)量控制,并為該產(chǎn)品的深度開發(fā)與利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Mlli-Q超純水系統(tǒng)(美國Mllipore科技有限公司);FA-1104型電子分析天平(上海精勝科學(xué)儀器有限公司);LD-06A型六兩裝高速中藥粉碎機(jī)(上?？七_(dá)醫(yī)學(xué)儀器設(shè)備有限公司);高效液相色譜儀(1525控制泵,2487紫外檢測器,美國Waters公司);KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。所用的玻璃器皿等用具均經(jīng)10%硝酸浸泡48 h后,用超純水洗凈。試驗用迷迭香葉片采自河南禹州市森源本草天然產(chǎn)物有限公司藥用植物GAP生產(chǎn)基地,采收后自然陰干,經(jīng)測定含水率為9.5%,經(jīng)過鄭州牧專生藥學(xué)實驗室趙建平教授鑒定性狀,為迷迭香屬植物迷迭香的葉片無誤。藥品:鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)品購于中國藥品生物制品檢定所,為含量測定用;乙腈為色譜純,購于美國Sigma-Aldrich公司;2次蒸餾水,自制;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:DiamonsilRC18(200 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(60∶40);紫外檢測器測定鼠尾草酸檢測波長為230 nm;采用等度洗脫,流速為0.8 mL/min;進(jìn)樣量10μL;柱溫:30℃;調(diào)節(jié)pH值為4.5～5.0;靈敏度:0.5AUFS[3]。在上述條件下,鼠尾草酸在25 min左右出峰,且峰形良好,其中230 nm是最大吸收波長(見圖1),靈敏度高,重現(xiàn)性好,同時在230 nm處,樣品譜圖中雜質(zhì)干擾較少,選用乙腈做流動相,柱效高,基線平穩(wěn),峰形、分離效果最好,樣品中鼠尾草酸的峰形及與其他雜峰的分離度最為理想。

圖1 鼠尾草酸紫外吸收光譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 用電子天平精密稱取105℃干燥4 h后至質(zhì)量恒定的的鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg、5.0 mg,置于 50 mL 棕色容量瓶中,用70%乙醇溶解并稀釋至刻度定容,搖勻,其濃度分別為200 mg/L、100 mg/L,作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。置于冰箱中避光保存,臨用時用流動相稀釋至不同的濃度。

2.3 供試品溶液的制備 選取迷迭香植物的葉片篩選去除沙石等機(jī)械雜質(zhì)后進(jìn)行切斷處理(約1 cm),采用水上蒸餾法蒸出揮發(fā)油,自然陰干后粉碎,并過孔徑 0.85 mm的藥篩。精密稱取樣品1.000 g(精確至0.001 g)置于錐形瓶中,按料液比1∶50(m/V)加入95%乙醇50 m L,超聲提取 60 min,用乙醇定容至50 m L,用0.45μm的微孔濾膜濾過,取濾液作為供試品溶液。根據(jù)含量高低稀釋成上機(jī)液,按上述色譜條件進(jìn)樣分析[4]。每項試驗平行3次。

2.4 測定方法的驗證

2.4.1 線性關(guān)系的考察 分別精密量取制備好的標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.0、2.0 、3.0、4.0、5.0、10.0 m L 置于 10 m L棕色容量瓶中,用流動相稀釋定容成10 mL,配制成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,各進(jìn)樣10μL進(jìn)行分析測定,記錄色譜圖,以峰面積A為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度C(g/L)為橫坐標(biāo),根據(jù)色譜結(jié)果,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)[4-5]。并對峰面積進(jìn)行回歸,計算線性回歸方程。鼠尾草酸在0.0087～0.0558 g/L呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為:y=2685.6 x-4.9472,R2=0.9998(n=6)。在上述色譜條件下,以信噪比S/N=3計算檢出限,表明峰面積與樣品質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系,線性范圍寬,檢出限低。測得鼠尾草酸的最小檢出限為0.058 mg/L。

圖2 鼠尾草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 精密度試驗 在上述色譜條件下,分別精密吸取質(zhì)量濃度為25、50、100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白樣中,每個濃度水平重復(fù)進(jìn)樣6次,測定其峰面積,計算 RSD。RSD值在 0.61%～1.02%,表明分析結(jié)果的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 分別精密吸取同一供試品溶液 10 μL,每6 h左右進(jìn)樣 1次,分別在 0、6、12、24、48 h進(jìn)行測定、記錄鼠尾草酸的峰面積,以峰面積計算RSD。RSD值為2.18%(n=5),說明供試品溶液在室溫條件下放置30 h比較穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號樣品粉末0.500 g(精確至 0.001 g),共6份 ,進(jìn)樣10μL,按外標(biāo)法計算。測得迷迭香鼠尾草酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.59%,RSD值為1.08%(n=6),說明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 回收率試驗 精密稱取已知鼠尾草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2.59%)的迷迭香粉末0.100 g(精確至0.001 g)作為空白樣品,分別置于50 m L量瓶中,每3份為1組,分別準(zhǔn)確加入鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液10.0、20.0、30.0 m L,取10μL 注入液相色譜儀,測定計算3種濃度(低、中、高)的加樣回收率,平行測定6次[6]。結(jié)果見表1,表明本方法鼠尾草酸回收率在98.0%～100.8%,平均回收率為99.5%(n=6)。說明利用此方法測定迷迭香中的鼠尾草酸是可行的,其所得數(shù)據(jù)是可靠的,該方法定量準(zhǔn)確,重復(fù)性好,符合測試要求。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.5 樣品測定 精密稱取不同批次(按日期編號)的迷迭香葉片樣品20.000 g(精確至0.001 g),精密吸取各樣品溶液各10μL,分別進(jìn)樣,注入液相色譜儀進(jìn)行測定,每項試驗平行3次,按外標(biāo)法定量,以峰面積取平均值,代入回歸方程,計算樣品中鼠尾草酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見表2。

表2 不同采收期迷迭香中鼠尾草酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%,n=3)

3 小結(jié)與討論

本文對不同采收期的迷迭香樣品采用HPLC法對其中的鼠尾草酸的含量進(jìn)行測定,運(yùn)用DiamonsilRC18(200 mm×4.6 mm,5μm)作為分析柱進(jìn)行測定,選用乙腈做流動相,乙腈和水比例為60∶40,采用等度洗脫,流速為 0.8 m L/min,檢測波長為230 nm,進(jìn)樣量 10μL,柱溫:30℃;p H 值4.5～5.0。通過對線性關(guān)系的考察、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗和加樣回收率試驗對測定方法進(jìn)行了驗證,結(jié)果表明,鼠尾草酸在 0.0087～0.0558 g/L呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為:y=2685.6 C-4.9472,R2=0.9998(n=6),平均回收率為99.5%。通過驗證表明,該方法靈敏、定量準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,且分析時間短,符合測試要求,可用于迷迭香中鼠尾草酸的含量測定。

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[3]何默忠,葛秀丹,陳正收,等.反相高效液相色譜法測定迷迭香中鼠尾草酚、鼠尾草酸和熊果酸含量[J].上海醫(yī)藥,2009,30(10):469-470.

[4]呂岱竹,王明月,袁宏球,等.高效液相色譜法測定迷迭香超臨界提取物中的鼠尾草酸和鼠尾草酚[J].分析測試學(xué)報,2006,25(3):109-111.

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