伍清林,金蘭梅,周正凱,鄧長林,徐 雪,徐 蕾,李曉峰

(1.金陵科技學院動物科學與技術學院,江蘇南京210038;2.南京紅山森林動物園,江蘇南京210037)

大腸埃希氏菌是人和動物腸道中的一種共棲菌,在特定條件下可致大腸桿菌病,并能夠隨著糞便排出而污染環(huán)境。大腸埃希氏菌在空氣中,特別在動物舍及其周圍環(huán)境中是一種常見菌。在珍禽養(yǎng)殖中大腸桿菌病也常有發(fā)生,據(jù)報道[1-3]孔雀、麻雞、珠雞等珍禽均有大腸桿菌病發(fā)生,且發(fā)病率達50%以上。對于禽大腸桿菌病多采用藥物治療,常用抗菌藥的濫用,大腸桿菌對多數(shù)抗菌藥的耐藥性越來越強,臨床上對大腸桿菌病的防治越來越困難。本試驗以南京紅山森林動物園珍禽繁殖場為研究對象,調(diào)查不同的珍禽大腸桿菌菌含量變化規(guī)律,分離致病性大腸桿菌,通過藥敏試驗,選用合理有效的抗生素,為動物園內(nèi)珍禽的疾病預防和保健措施提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物園珍禽繁殖場情況 南京紅山森林動物園珍禽繁殖場,在動物園內(nèi)小紅山腳下,遠離動物展區(qū)500 m以上,飼養(yǎng)孔雀等十幾種珍禽。禽舍分南北和東西兩種走向,每個禽舍內(nèi)面積約5～8 m2,有運動場,每間禽舍飼養(yǎng)的數(shù)量在4～30只不等,每天清掃3次,每周消毒1次(遇到下雨延期)。

試驗于2010年1月,選擇藍孔雀、原雞、白鷴、綠孔雀、白孔雀、麻雞、白冠長尾雉、戴冕鶴、紅腹錦雞等9種珍禽舍進行空氣樣本和直腸糞便。

1.2 試驗材料

1.2.1 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂(NA)、伊紅美藍瓊脂(EMB),購于國藥集團化學試劑有限公司;麥康凱瓊脂(MAC)、沙門菌、志賀氏菌屬瓊脂(S.S.)、腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管和藥敏質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922,均購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2.2 藥敏紙片 共 20種,包括頭孢菌素類6種：頭孢噻吩(CEF)、頭孢哌酮(CFP)、頭孢吡肟(CPM)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢三嗪(CTR);氨基糖苷類5種：鏈霉素(STR)、卡那霉素(KAN)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、妥布霉素(TOB);氟喹諾酮類3種：氟羅沙星(FLX)、環(huán)丙沙星(CIP)、諾氟沙星(NOR);青霉素類3種：氧呱嗪青霉素(PIP)、羧芐青霉素(BAR)、氨芐青霉素(AMP);磺胺類：復方新諾明(SXT);四環(huán)素類：四環(huán)素(TET);硝基呋喃類：呋喃妥因(AHD),購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2.3 試驗動物 普通級小鼠體重18～22 g、普通級家兔,均購于南京盛民科研實驗動物場。

1.3 試驗方法

1.3.1 環(huán)境空氣和珍禽體內(nèi)樣本采集 參照中華人民共和國國家標準公共場所空氣微生物檢驗方法細菌總數(shù)測定中的自然沉降法[4]采集空氣樣本。在每間禽舍取中央(編號為1)和運動場(編號為2)2個點,3種培養(yǎng)基,計6個平皿,9間禽舍,共計54個平皿。瓊脂平板于離地高度為1.2 m,打開平皿蓋暴露空氣中10 min,然后將平皿置37℃恒溫溫箱中培養(yǎng)24 h。

用無菌棉簽從藍孔雀等9種的泄殖腔拭子涂于MAC、S.S.等培養(yǎng)基上。

1.3.2 大腸桿菌分離鑒定 分別取MAC、S.S.等培養(yǎng)基上典型紅色菌落,涂片,革蘭染色,鏡檢,初步區(qū)分革蘭陽性和陰性菌,然后做腸桿菌科細菌生化鑒定,并轉(zhuǎn)接種于伊紅美藍和三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基,觀察反應結果,確認大腸桿菌。

1.3.3 致病性試驗 將上述生化反應已鑒定為大腸桿菌的菌株接種于普通肉湯,37℃培養(yǎng)18 h。取肉湯培養(yǎng)物分別腹腔注射小鼠,每株做3個重復。對照組小鼠腹腔注射滅菌生理鹽水0.5 mL/只。觀察小鼠的活動及發(fā)病死亡情況,對發(fā)病死亡小鼠立即進行剖檢,觀察病變,取其病料涂片,染色,鏡檢,并接種于MAC培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。未發(fā)病的繼續(xù)觀察至1周。

1.3.4 藥敏試驗 采用WHO推薦的Kirby-Bauer法[5]。依據(jù)NCCLS有關標準,每次測定均以質(zhì)控菌為對照,只有當質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)測試菌株結果才有效。判定標準參照美國國家臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)M100-S15[6]和文獻[7],以敏感、中介、耐藥3種形式對抑菌圈大小作出判定。

2 結果

2.1 菌株分離與鑒定 從采集的樣本中分離到6種腸桿菌科細菌,共69個菌株,其中大腸桿菌27株占分離菌的39.13%(27/69),9種珍禽舍內(nèi)和體內(nèi)均分離到大腸桿菌,達100%的分離率,說明大腸桿菌在珍禽舍環(huán)境中和體內(nèi)普遍存在。結果見表1。

分離到了27株大腸桿菌,在伊紅美藍瓊脂上均形成黑色、帶金屬光澤的菌落,均為革蘭陰性、兩端鈍圓的小桿菌、單在或成對存在。各菌均可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇,產(chǎn)酸產(chǎn)氣;少數(shù)菌株發(fā)酵蔗糖,只產(chǎn)酸或產(chǎn)酸并產(chǎn)氣;M.R.試驗陽性;V-P試驗陰性;產(chǎn)生靛基質(zhì);尿素酶試驗陰性;硝酸鹽還原試驗陽性;吲哚試驗陽性;枸櫞酸鹽利用試驗陰性;三糖鐵斜面、底層產(chǎn)酸變黃,有氣體,無變黑現(xiàn)象。

表1 珍禽環(huán)境空氣中的腸桿菌科菌數(shù) (株)

2.2 動物致病性試驗 27株大腸桿菌接種小鼠后,24 h內(nèi)有14株接種的42只小鼠精神委靡,腹瀉,飲水增加,有水樣糞便后死亡;有8株接種的24只小鼠,接種后出現(xiàn)不同程度的精神沉郁、拉稀等臨床癥狀,72 h內(nèi)有16只死亡,其余的8只48 h后漸漸開始恢復,至72 h時基本已恢復至健康狀態(tài);其余健活。剖檢死亡小鼠均見內(nèi)臟充血,肝臟腫大,有出血點和壞死點;腸嚴重臌氣,腸管變薄,心包淤血,肺出血,脾臟淤血。從死亡小鼠的心血和肝臟中均分離出大腸桿菌。由此可見,27株大腸桿菌有14株致病性較強,8株有致病性,5株無致病性。

2.3 耐藥性監(jiān)測 選擇20種抗菌藥物對9種珍禽舍環(huán)境中和珍禽體內(nèi)的18株大腸桿菌進行藥敏試驗,20種抗菌藥物中抑菌作用最強的為CEF、TOB、STR和AHD,敏感菌株占(17/18)94.44%;其次為 CFP、KAN、AMK(16/18),(88.89%);CPM(14/18)(77.78%);CTR、GEN(13/18),(72.22%)。18株大腸桿菌對抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性,耐藥菌株分別占BAR(18/18),(100%);NOR(16/18),(88.89%);PIP、AMP(15/18),(83.33%);CIP、TET(14/18),(77.78%);FLX(9/18),(50%)。結果見表2和表3。

表2 18株大腸桿菌藥敏試驗結果 (mm)

2.4 大腸桿菌的耐藥性和耐藥類型 18株受試大腸桿菌均對20種抗菌藥物有多重耐藥性,表現(xiàn)對4種或4種以上藥物耐藥。7耐菌株所占比例最大,為22.22%(4/18);其次是5耐和9耐均為16.67%。多重耐藥現(xiàn)象嚴重,最少為4種,最多為12種。最普遍的耐藥類型是BAR-AMP-TET-CIP-NOR-PIPFLX,其次為 BAR-AMP-TET-SXT-CIP-NOR-PIPFLX。見表4。

表3 20種抗菌藥物對18株大腸桿菌耐藥性監(jiān)測試驗結果

表4 18株大腸桿菌耐藥譜型

3 小結與討論

3.1 動物園繁殖場飼養(yǎng)的各種珍禽數(shù)量雖然少,但是種類多,飼養(yǎng)環(huán)境同其他畜牧場所相似,都屬于集約化養(yǎng)殖,據(jù)動物園病例記載,在珍禽中常有大腸桿菌病發(fā)生。本試驗從9間珍禽舍的環(huán)境空氣中和9種珍禽體內(nèi)分離到大腸桿菌27株,其中14株致病性較強,致病率占58.33%,說明動物園繁殖場珍禽舍已受到致病性大腸桿菌的污染,平時應注意監(jiān)測,做好消毒工作。

3.2 NCCLS早在1993年就頒布了由世界衛(wèi)生組織認可的紙片擴散法藥敏試驗法規(guī),其采用耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)三級報告,且為一菌一藥一判斷界值。本次對18株大腸桿菌耐藥性監(jiān)測的試驗結果是參照NCCLS法規(guī)頒布的標準進行。從藥敏試驗結果可以看出,大腸桿菌敏感率達70%以上的主要藥物有頭孢噻吩、頭孢哌酮、頭孢吡肟、頭孢三嗪、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、呋喃妥因等。其中頭孢噻吩、鏈霉素、妥布霉素、呋喃妥因等敏感率達94.44%,此結果對于動物園珍禽繁殖場有效防治大腸桿菌病具有一定的參考價值。

3.3 大腸桿菌作為腸道常在菌,在條件變差及其他病原感染后易繼發(fā)致病,并且其血清型眾多、抗原復雜、容易形成耐藥性,在實際生產(chǎn)中疫苗預防和藥物防治效果不理想。目前我國畜禽大腸桿菌耐藥性嚴重而復雜,對大多數(shù)抗菌藥物都已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性[8]。試驗的18株大腸桿菌都為多重耐藥菌株,耐藥性最少的菌株耐4種抗菌藥物,耐藥性最多的菌株耐12種,其中以7種耐藥最多。通過18株大腸桿菌對20種抗菌藥物的耐藥類型觀察發(fā)現(xiàn),對氟喹諾酮類耐藥的大腸桿菌,同時對青霉素類、四環(huán)素等抗菌藥的耐藥率在70%以上。說明受試菌不僅對同一類抗菌藥中數(shù)種抗菌藥物存在交叉耐藥,而且對不同類抗菌藥物存在嚴重的多重耐藥。這與田勇等[9]報道的相符。多重耐藥現(xiàn)象的存在,給珍禽大腸桿菌病的藥物防治提出了新的課題。因此,在臨床治療過程中,首先要進行藥敏試驗,可以選擇幾種比較敏感的藥物合用或交替使用,以減少單一藥物的使用劑量或使用時間,減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

3.4 本次試驗顯示,細菌的耐藥性不僅出現(xiàn)在規(guī)?；B(yǎng)殖的家畜家禽中間,在野生禽類中也已經(jīng)出現(xiàn)明顯的耐藥現(xiàn)象,值得廣大科研工作者的關注。分離的27株大腸桿菌血清型是否相同?是否有同源性?有待于進一步研究。

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[4] GB/T18204.1-2000.公共場所空氣微生物檢驗方法,細菌總數(shù)測定[S].

[5] National Committee for Clinical Laboratory Standards.Perform ance st andards for antimicrobial su sceptibility testing[M].Penns y lvania：NCCLS,2001：1-23.

[6] 李剛,文英,鐵生虎,等,規(guī)模化豬場仔豬致病性大腸埃希菌的耐藥性檢測[J].動物醫(yī)學進展,2010,31(8)：117-121.

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[9] 田勇,鄭雪花,張建軍,等.雞源大腸埃希氏菌多藥耐藥性的檢測與分析[J].中國獸醫(yī)雜志,2008,44(1)：18-21.