董劍輝,熊惠軍,宋 立,陳 瑞

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 海淀 100081)

喹諾酮類藥物是獸醫(yī)臨床治療動(dòng)物細(xì)菌性疾病一類常用抗菌藥物,此類藥物的廣泛應(yīng)用,使動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)其耐藥性也隨之逐漸上升[1]。細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要是染色體介導(dǎo)的靶位改變、膜通透性改變和主動(dòng)外排。近年來,質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥(plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)基因 qnrA[2],qnrB[3]、qnrS[4]相繼出現(xiàn),aac(6′)-Ib-cr和qep A這兩種質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因也被證實(shí)[5-6]。本試驗(yàn)通過微量肉湯稀釋法,檢測2009年雞源大腸桿菌的耐藥情況,選擇耐喹諾酮類藥物的菌株,采用PCR方法檢測PMQR基因,以了解不同地區(qū)雞源大腸桿菌中PMQR基因的流行情況。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2009年從福建、廣西、天津等地的蛋雞場,采泄殖腔拭子,用麥康凱培養(yǎng)基分離、API 20E試條鑒定,分別分離到大腸桿菌 76、44、62株,共計(jì)182株。

1.2 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、MH肉湯由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎(chǔ)保障室提供;抗菌藥藥敏板購自天津金章科技發(fā)展有限公司;API 20E試條購自BioMerieux公司;DNA Marker DL-2000購自 TaKa Ra公司;BtsCI購自NEB公司;Go Taq G reen Master Mix購自Promega公司;大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.3 耐藥性測定 用藥敏板進(jìn)行檢測,試驗(yàn)方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)參考臨床與試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)所推薦的微量肉湯稀釋法。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Gen Bank已知的序列,用Premier 5.0分別設(shè)計(jì)出5個(gè)基因的特異性引物(見表1),由Invitrogen公司合成。

表1 PC R引物序列

1.5 PCR擴(kuò)增 用煮沸法提取DNA模板。根據(jù)不同的反應(yīng)條件 PCR擴(kuò)增 qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-Ib和qep A 基因,對(duì)于aac(6′)-Ib的陽性株,膠回收后用BtsCI酶切,aac(6′)-Ib能被酶切,而 aac(6′)-Ib-cr不能被酶切。擴(kuò)增陽性產(chǎn)物均送 Invitrogen公司測序,驗(yàn)證質(zhì)粒序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 182株雞源大腸桿菌對(duì)13種抗菌藥物的耐藥率排序如下:四環(huán)素(96.15%)、磺胺異噁唑(92.86%)、復(fù)方新諾明(86.26%)、氨芐西林(80.77%)、氟苯尼考(78.02%)、阿莫西林/克拉維酸(73.08%)、恩諾沙星(74.73%)、氧氟沙星(65.93%)、慶大霉素(45.60%)、頭孢噻呋(33.52%)、頭孢唑林(28.02%)、阿米卡星(15.93%)、多粘菌素E(9.89%)。

2.2 PMQR基因檢測結(jié)果 挑取耐恩諾沙星或氧氟沙星的菌株共166株,除qnrB外,PCR對(duì)其余四種質(zhì)粒均有檢出(見表2)。部分陽性株電泳結(jié)果見圖1。

表2 不同地區(qū)大腸桿菌PMQR基因陽性率

圖1 陽性PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

喹諾酮類藥物在獸醫(yī)臨床上的大量使用,導(dǎo)致了大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥率的上升。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出,2009年部分地區(qū)的雞源大腸桿菌,對(duì)獸醫(yī)臨床常用抗菌藥存在耐藥現(xiàn)象,對(duì)四環(huán)素、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、氨芐西林、氟苯尼考、阿莫西林/克拉維酸、恩諾沙星、氧氟沙星等的耐藥率均大于65%,這可能與這類藥物的廣泛使用有關(guān);而對(duì)阿米卡星、多粘菌素的耐藥率均小于20%,不同藥物的耐藥率差別較大,這可能與使用的藥物不同有關(guān)。

目前,PMQR基因的廣泛存在已經(jīng)在世界范圍內(nèi)得到證實(shí)[7],各種基因的陽性率從1%～36%不等[4,8-9]。本研究對(duì)166株耐喹諾酮藥物的雞源大腸桿菌進(jìn)行PMQR基因的檢測,共檢測到1株qnrA陽性菌株,16株qnrS陽性菌株,26株aac(6′)-Ib-cr陽性菌株和4株qepA陽性菌株,其陽性率分別為0.60%、9.64%、15.66%、2.41%,以 qnrS 和 aac(6′)-Ib-cr這兩種基因?yàn)橹?。從不同地區(qū)PMQ R基因的檢測結(jié)果來看,qnrA和qepA分別只在福建和廣西的分離株中檢出;對(duì)于qnrS基因,在天津的48株大腸桿菌中,陽性率為 20.83%,遠(yuǎn)高于福建(5.41%)和廣西(4.55%)兩個(gè)地區(qū) ;而 aac(6′)-Ibcr基因在福建(22.97%)和天津(14.58%)的分離株中,陽性率也較高。由此可見,PMQR基因陽性的檢出率可能與分離株的地域性有一定的關(guān)系。另外,由于菌株采集的數(shù)量以及不同養(yǎng)殖場用藥情況的不同,也可能造成PMQR基因檢出率的差異。

由于PMQR基因可在不同微生物間進(jìn)行水平傳播,將會(huì)加快喹諾酮類藥物耐藥性在細(xì)菌間的傳播,從而導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性進(jìn)一步增強(qiáng)。因此,有必要在國內(nèi)進(jìn)行全面的喹諾酮類藥物耐藥性機(jī)理研究和PMQR基因的檢測,建立相關(guān)數(shù)據(jù)庫,以指導(dǎo)合理使用喹諾酮類藥物,從而減少喹諾酮類藥物耐藥菌的產(chǎn)生和耐藥質(zhì)粒的傳播。

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