龐 然,張小敏,周 斌,何丹妮,陳溥言

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒感染引起的豬的急性、熱性、高度致死性傳染病,是嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類l6種傳染病之一,我國亦將其列為一類傳染病,是發(fā)生最多、危害最大、流行最廣的動(dòng)物傳染病之一。由于長期貫徹預(yù)防為主的指導(dǎo)思想,堅(jiān)持廣泛接種豬瘟兔化弱毒疫苗的防治措施,該病在我國已經(jīng)得到有效控制,大規(guī)模的暴發(fā)流行基本停止[1]。2009年,一些豬場發(fā)生典型的豬瘟,給豬場造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[2],致使許多獸醫(yī)工作者和養(yǎng)豬業(yè)主對我國豬瘟疫苗的免疫效果產(chǎn)生了懷疑,從而給我國豬瘟的防制工作帶來新的問題。

按照農(nóng)業(yè)部《高致病性禽流感、口蹄疫等重大動(dòng)物疫病免疫方案》和省屬要求,豬瘟免疫抗體檢測采用正向間接血凝試驗(yàn)(IHA)或者酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)2種方法。ELISA是應(yīng)用最廣,發(fā)展最快的一項(xiàng)新技術(shù),其基本過程是將抗體(或抗原)吸附于固相載體,在載體上進(jìn)行免疫酶反應(yīng),底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果[3]。ELISA有間接法、夾心法、競爭法和阻斷ELISA等。然而目前國內(nèi)對豬瘟抗體的檢測方法較多,主要 IHA、Dot-ELISA和豬瘟抗體免疫金標(biāo)試紙,在實(shí)際檢測工作開展中常會(huì)碰到一些問題,而且不同檢測能力水平對檢測結(jié)果有所影響,檢測操作技能要求高的試驗(yàn)方法難以在基層推廣應(yīng)用,為提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性,結(jié)合操作技能要求,我們選擇了4種商品化的豬瘟抗體檢測試劑盒進(jìn)行了比對試驗(yàn),將試驗(yàn)結(jié)果作一分析總結(jié)如下,供同行參考。

1 材料與方法

1.1 檢測試劑盒 (1)IHA試劑盒:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn),批號:100314。(2)進(jìn)口阻斷ELISA試劑盒:美國IDEXX公司生產(chǎn),批號:99-43220S671。(3)進(jìn)口阻斷ELISA試劑盒:法國LSI公司生產(chǎn),批號:9F2F。(4)進(jìn)口阻斷試劑盒:韓國JBT公司生產(chǎn),批號:107304SD15。

1.2 試驗(yàn)血清 根據(jù)豬的日齡選取免疫背景清楚的血清共70份,且該70份血清已經(jīng)經(jīng)過中和試驗(yàn)檢測。其中母豬10份,60日齡豬16份,100日齡豬10份,后備種豬34份。

1.3 檢測 檢測試劑盒均在有效期內(nèi),檢測操作按盒內(nèi)說明書進(jìn)行,各試劑檢測對照均成立,檢測結(jié)果按試劑盒要求判定。

1.4 檢測數(shù)據(jù)處理分析 以中和試驗(yàn)數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算4種試劑盒的檢測結(jié)果值相對中和試驗(yàn)檢測結(jié)果值的特異性、敏感性和結(jié)果符合率,以期得出相對穩(wěn)定和符合率高的試劑盒,以有利于臨床的檢測和指導(dǎo)。

1.5 中和試驗(yàn)檢測臨床70份血清 采用熒光抗體染色法進(jìn)行中和試驗(yàn),方法如下:將CSF陽性、陰性血清及待檢血清按 1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀釋。每份待檢血清設(shè)4個(gè)重復(fù),將CSFV石門株稀釋至100TCID50/0.1 mL,與等體積的稀釋后的血清混合,于37℃反應(yīng)1 h。接種PK-15細(xì)胞,100μL/孔(病毒100TCID50/孔)。72 h后用800 m L/L冷丙酮固定,將CSF陽性血清作50倍稀釋,100μL/孔,37℃反應(yīng) 1.5 h,加入50倍稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG 50μL/孔,在37℃反應(yīng)1 h后,用200μL PBS T洗滌5次,每次 5 min,加入30 μL 50 m L/L的甘油生理鹽水,在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 4種豬瘟抗體檢測試劑盒對70份臨床血清的檢測 中和試驗(yàn)對70份豬血清進(jìn)行豬瘟抗體定性檢測后,按試劑盒說明書,分別用 3種商品化ELISA試劑盒和1種正向間接血凝試劑盒依次對豬瘟抗體陽性血樣和陰性血樣進(jìn)行重復(fù)性檢測。計(jì)算4種商品化試劑盒相對中和試驗(yàn)的符合率(包括敏感性和特異性)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中和試驗(yàn)及4種試劑盒檢測70份臨床血清70份血樣經(jīng)中和試驗(yàn)(100TCID50/孔)測定,4種試劑盒重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2 4種試劑盒相對中和試驗(yàn)的符合率

2.2.1 IDEXX試劑盒相對中和試驗(yàn)的符合率IDEXX試劑盒檢測到20份陰性,50份陽性。其中50份兩種方法檢測均為陽性,10份兩種方法檢測均為陰性。計(jì)算得出 IDEXX試劑盒的特異性為100.0%(10/10),敏感性為83.3%(50/60),兩種檢測方法的結(jié)果符合率為85.7%[(50+10)/70][4]。見表2。

表1 中和試驗(yàn)及4種試劑盒檢測結(jié)果

表2 IDEXX試劑盒相對中和試驗(yàn)的比較試驗(yàn)

2.2.2 LSI試劑盒相對中和試驗(yàn)的符合率 LSI試劑盒檢測到12份陰性,58份陽性。其中57份兩種方法檢測均為陽性,9份兩種方法檢測均為陰性。計(jì)算得出LSI試劑盒的特異性為90.0%(9/10),敏感性為95.0%(57/60),兩種檢測方法的結(jié)果符合率為94.3%[(57+9)/70]。見表 3。

表3 LSI試劑盒相對中和試驗(yàn)的比較試驗(yàn)

2.2.3 JBT試劑盒相對中和試驗(yàn)的符合率 JBT試劑盒檢測到8份陰性,62份陽性。其中60份兩種方法檢測均為陽性,8份兩種方法檢測均為陰性。計(jì)算得出JBT試劑盒的特異性為80.0%(8/10),敏感性為100.0%(60/60),兩種檢測方法的結(jié)果符合率為97.1%[(60+8)/70]。見表 4。

表4 JBT試劑盒相對中和試驗(yàn)的比較試驗(yàn)

2.2.4 IHA試劑盒相對中和試驗(yàn)的符合率 IHA試劑盒檢測到7份陰性,63份陽性。其中55份兩種方法檢測均為陽性,2份兩種方法檢測均為陰性。計(jì)算得出IHA試劑盒的特異性為20.0%(2/10),敏感性為91.7%(55/60),兩種檢測方法的結(jié)果符合率為81.4%[(55+2)/70]。見表 5。

表5 IHA試劑盒相對中和試驗(yàn)的比較試驗(yàn)

2.2.5 4種試劑盒相對中和試驗(yàn)的符合率比較總結(jié) 見表6。

表6 4種試劑盒相對中和試驗(yàn)的符合率比較

3 討論

從試驗(yàn)結(jié)果看,特異性上IDEXX最高,LSI次之,JBT第三,IHA最低。敏感性上JBT最高,LSI次之,IHA第三,IDEXX最低。在試劑盒的符合率比較中,JBT的符合率最高,LSI第二,IDEXX次之,IHA最低。

LSI試劑盒使用酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白作為酶標(biāo)抗體,即PPA-ELISA,它檢測的是豬體內(nèi)的總抗體。不能區(qū)分BVDV和BDV,也有可能出現(xiàn)假陽性。所以更適合于抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測和免疫效果評價(jià)。

JBT試劑盒采用的是豬瘟抗體競爭ELISA法,該法是建立在多重誘捕阻斷ELISA技術(shù)上,使用了CSFV E2抗原和單克隆抗體,如果樣品中存在抗E2糖蛋白的抗體,那么加入辣根過氧化物酶結(jié)合的抗E2糖蛋白單克隆抗體以及顯色底物后,顏色將不會(huì)加深。它是一種用來檢測豬血清中抗E2糖蛋白的抗體,是一種快速、簡單、特異的方法,可以排除其他瘟病毒抗體,比如BVDV抗體的交叉反應(yīng)。且包被抗原為真核的JBT試劑盒比原核的愛德士試劑盒的親和性更高,敏感性更強(qiáng)。

IDEXX公司的ELISA豬瘟病毒抗體檢測試劑盒所用的抗原是通過基因工程的方法生產(chǎn)的,純度更高,此試劑盒采用阻斷ELISA的模式,所用的單抗針對E2蛋白,檢測E2抗體[6]。但它只能識別豬瘟兩個(gè)位點(diǎn)中的一個(gè),它所檢測的是豬瘟病毒特異性抗體,且抗原為原核表達(dá)產(chǎn)物。因此檢測結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)假陰性,不適合抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測和免疫效果評價(jià),但該種試劑盒可以區(qū)分BVDV和BDV,可以在引種監(jiān)測和個(gè)體淘汰中廣泛應(yīng)用[5]。

IHA檢測血清中豬瘟全病毒抗體,不能區(qū)分豬血清中的BVDV和BDV抗體[6-7],而豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)具有共同的糖蛋白抗原,即有血清學(xué)的交叉反應(yīng)。而國外試劑盒所用的阻斷ELISA模式所用的單抗只是針對豬瘟病毒中某種具有特異性的蛋白,從而檢測所對應(yīng)的特異性抗體,所以從某種程度上來說可以避免與BVDV發(fā)生交叉反應(yīng),提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。豬瘟IHA試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)就是不需要特殊檢測儀器,直接用肉眼即可判定結(jié)果,適于在基層推廣。但這也決定了其試驗(yàn)結(jié)果判定受主觀人為因素影響極大,同時(shí)IHA的低特異性對檢測結(jié)果帶來困惑。

綜上所述,從本次試驗(yàn)結(jié)果分析來看,4種方法均可使用,但最好使用LSI或JBT或IDEXX等進(jìn)口ELISA試劑盒。以上4種方法根據(jù)實(shí)際情況加以靈活應(yīng)用,不僅能夠保證免疫監(jiān)測工作的完成,且能夠?yàn)榉乐曝i瘟的暴發(fā)提供可靠的依據(jù),還可以解決實(shí)際供應(yīng)緊張等問題。但筆者認(rèn)為,一個(gè)豬場進(jìn)行疫病的免疫監(jiān)測時(shí),為了掌握疫苗免疫效果如何(如抗體水平、均勻度、持續(xù)時(shí)間),確定母源抗體消長規(guī)律,建立豬場免疫基線水平,最好不要經(jīng)常變換檢測方法,相對穩(wěn)定的檢測方法有利于豬場建立檔案資料,為指導(dǎo)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。所以我們要合理的選用試劑盒,更好的為生產(chǎn)服務(wù)。

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[2]楊漢春.盤點(diǎn)養(yǎng)豬2009之:我國主要豬病流行概況[J].豬業(yè)科學(xué),2010,1:11-12.

[3]楊漢春.動(dòng)物免疫學(xué)[M].2版.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2003:314.

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