徐守振,汪 明

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東 青島 266109;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

雞球蟲病(coccidiosis of chickens)是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的常見寄生蟲病。由于雞球蟲活苗存在安全性和使用不便等缺點,因此尋找一種更安全、穩(wěn)定和高效的新型疫苗成為亟待解決的問題。DNA疫苗具有制備簡單、可持續(xù)誘導(dǎo)體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)等優(yōu)點,近年來成為雞球蟲疫苗研究的熱點[1]。研究發(fā)現(xiàn)針對雞球蟲單一保護(hù)性抗原的DNA疫苗不具備完全的免疫保護(hù)[2-3],研制含多個保護(hù)性抗原的多價DNA疫苗可能是提高保護(hù)效果的策略之一。

本試驗將E.tenella 3-1E和CDPK兩基因融合構(gòu)建了雙抗原DNA疫苗,研究其免疫保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1日齡AA肉雞,購自北京華都肉雞有限公司。

1.2 蟲株和質(zhì)粒 E.tenella GS敏感蟲株、真核載體proVAX、PK-15細(xì)胞為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲教研室保存。pGEX-C原核質(zhì)粒和pro E真核質(zhì)粒為試驗前期構(gòu)建。

1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、XhaⅠ、XbaⅠ、AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA連接試劑盒、DNA回收純化試劑盒,為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。EndoFree Plasmid Maxi Kit,QIAGEN公司產(chǎn)品。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(LipofectamineTM),Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.4 引物設(shè)計 根據(jù)E.tenella 3-1E和CDPK基因序列及SOE-PCR引物設(shè)計原理,設(shè)計4條引物如 下 。 P3:5′-CCGGAAT TCATGGGTGAAGAGGCTGATAC-3′,P10:5′-ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGAAGCCGCC CTGG TACAG-3′,P9:5′-GGT TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGG TGGCGGA TCGA TGCCGGCAGCGTCCAAGTCAG-3′,P6:5′-TGCTCTAGA CTACGCCGCGGTA TCTCCGCAC-3′,兩基因序列間 linker1:5′-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-3′,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 融合基因擴(kuò)增 以pro E為模板,P3、P10引物擴(kuò)增 3-1E-linker1,條件:94℃5 min,94℃1 min,58℃1 min,72℃1 min,30個循環(huán);72℃10 min。以pGEX-C為模板,P 9、P 6引物擴(kuò)增linker1-CDPK,條件:94℃5 min,94℃1 min,64℃1 min,72℃1.5 min,72℃10 min,30個循環(huán)。各取1μL回收純化的兩片段作模板,P 3、P6引物擴(kuò)增3-1E/CDPK(EC)融合基因,條件:94℃5 min,94℃1 min,58℃1 min,72℃2 min,3個循環(huán);94℃1 min,60℃1 min,72℃2 min,3個循環(huán);94℃1 min,62℃1 min,72℃2 min,3個循環(huán);94℃1 min,64℃1 min,72℃2 min,20個循環(huán);72℃10 min。

1.6 真核質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 將EC融合基因、pGEXC、proVAX 分別用Eco RⅠ+XbaⅠ雙酶切,連接、轉(zhuǎn)化及酶切鑒定均按常規(guī)方法操作,鑒定正確的陽性克隆命名為proEC和proC。無內(nèi)毒素的proC和proEC質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后30 h用間接免疫熒光試驗(IFAT)檢測重組質(zhì)粒中目的蛋白表達(dá)情況,首抗為兔抗rIEC重組蛋白抗體(1∶100),二抗為羊抗兔FITC標(biāo)記抗體(1∶200)。

1.7 動物分組與處理 5日齡AA肉雞隨機(jī)分為空白對照組、攻蟲對照組、proVAX組、proE組、proC組和 pro EC組;7日齡,首次免疫 porVAX、pro E、pro C和pro EC(50μg/只);14日齡,加強(qiáng)免疫1次;21日齡,稱重,感染5×104個 E.tenella GS株孢子化卵囊;28日齡,稱重、剖殺。

1.8 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 27日齡,心臟采血 2 mL/只,按常規(guī)方法做淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(M TT法),用特異刺激抗原rIEC和非特異刺激抗原ConA分別刺激分離的淋巴細(xì)胞,計算刺激指數(shù)SI=待測孔OD值/空白對照孔OD值。

1.9 血清抗體效價檢測 13、20、27日齡,翅靜脈采血,分離血清,間接ELISA檢測血清抗體效價,包被抗原為rIEC(1μg/孔),二抗為羊抗兔HRP-IgG(1∶1000)。

1.10 免疫保護(hù)效果評價 28日齡,稱重、剖檢,計算相對增重率、盲腸內(nèi)容物克糞便卵囊數(shù)(OPG)。

1.11 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 12.0軟件分析各組間差異。

2 結(jié)果

2.1 真核質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用Eco RⅠ+XbaⅠ對proC和proEC雙酶切后釋放出1500 bp和2000 bp的目的片段,用Eco RⅠ+XhaⅠ對proE雙酶切釋放出 500 bp的目的片段(見圖 1)。將proE、proC、proEC、proVAX 分別轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,熒光顯微鏡下可見proE、proC和pro EC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞漿出現(xiàn)特異黃綠熒光,轉(zhuǎn)染pro VAX的無特異熒光,表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.2 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化 攻蟲感染7 d后,ConA刺激后proEC組SI與其他各組差異顯著(P＜0.05);rIEC刺激后,proEC組SI除與proE組差異不顯著外與其他各組差異均顯著(見圖2),proEC組SI均最高。

圖2 DNA疫苗免疫后淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平變化

圖3 DNA疫苗免疫后抗體水平變化

2.3 血清抗體效價 各疫苗組抗體水平均隨免疫次數(shù)增加而緩慢提高(見圖3)。首免及二免后1周,proC組抗體水平均低于其他疫苗組且差異顯著(P＜0.05)。二免后1周,pro EC組高于其他各組且差異顯著(P＜0.05)。感染后1周,proEC組抗體水平最高且與其他各組差異顯著(P＜0.05),proE與pro C組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.4 免疫保護(hù)效果 由表1可見,疫苗組均可提高相對增重、降低卵囊產(chǎn)量,pro E組相對增重最高(87.39%),且與proC組和proEC組差異顯著(P＜0.05),而proEC組相對增重低于pro E組和proC組。proEC組OPG最低,與proE組和proC組差異不顯著(P＞0.05),proC組與proE組OPG差異也不顯著(P＞0.05)。

3 討論

雞球蟲屬于真核生物,寄生性原蟲,其生活史復(fù)雜,基因組較大,抗原基因構(gòu)成復(fù)雜,目前大多數(shù)含單一抗原的雞球蟲DNA疫苗免疫保護(hù)效果均不理想 。先前我們研究發(fā)現(xiàn),用含E.tenella3-1E和雞IFN-γ基因的融合質(zhì)粒pro IE免疫雞后能獲得比單價pro I和 proE更強(qiáng)的免疫保護(hù),說明細(xì)胞因子IFN-γ與雞球蟲3-1E抗原基因共表達(dá)可增強(qiáng)3-1E DNA疫苗的免疫保護(hù)力。因此,研制含多種保護(hù)性抗原的雞球蟲多價DNA疫苗預(yù)期可產(chǎn)生較好的保護(hù)。

表1 DNA疫苗免疫保護(hù)效果觀察

本試驗構(gòu)建了含E.tenella子孢子表面抗原3-1E和CDPK的雙價DNA疫苗攻蟲,免疫后發(fā)現(xiàn)雙價pro EC較單價proE和proC能進(jìn)一步降低卵囊產(chǎn)量,表現(xiàn)出一定的雙抗原融合表達(dá)的協(xié)同保護(hù)優(yōu)點,與周建民(2005)的研究結(jié)果基本一致[4]。為增強(qiáng)疫苗的保護(hù)效果本試驗選用proVAX真核表達(dá)載體,其具有CMV啟動子、BGH poly A和卡那霉素抗性基因,并攜帶有協(xié)助抗原蛋白進(jìn)入分泌途徑的人絨毛膜促性腺激素信號肽序列。此外,試驗采用SOE-PCR技術(shù)通過在兩基因間加入(GGGGS)315個具有良好柔順性和折疊性的接頭序列將兩基因融合,盡可能不影響3-1E和CDPK的天然結(jié)構(gòu),確保表達(dá)的兩抗原表位間不發(fā)生互相屏蔽。

本試驗雞球蟲DNA疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力強(qiáng)于誘導(dǎo)體液免疫能力,說明雞球蟲感染真正產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的細(xì)胞免疫,而體液免疫的作用很小。攻蟲感染后1周,除相對增重率外,proEC組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、抗體水平和卵囊下降率在各組中均為最高,四者間沒有呈現(xiàn)出完全一致的關(guān)系,說明雞球蟲DNA疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制十分復(fù)雜,仍需進(jìn)一步研究。

[1]吳紹強(qiáng),蔣金書,劉群,等.雞球蟲疫苗研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2005,36(1):1-5.

[2]徐守振,潘保良.雞IFN-γ與雞柔嫩艾美耳球蟲3-1E抗原共表達(dá)DNA疫苗的免疫保護(hù)性研究[J].中國獸醫(yī)雜志,2010,46(9):5-7.

[3]Song K D,Lillehoj H S,Choi K D,etal.A DNA vaccine encoding a conserved Eimeria protein induces protective immu nity against live E imeria acervu lina challenge[J].Vaccine,2000,19:243-252.

[4]周建民.雞球蟲3-1E和CDPK基因工程苗的研制及其免疫保護(hù)效果[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.