劉瑞平,趙公吟,韓云芳,張 輝,徐南偉

(南京醫(yī)科大學附屬常州二院,1.骨科;2.中心實驗室,江蘇常州,213003)

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種常見的慢性炎性疾病,病因還未完全明確,但在世界上有數百萬人患病。RA常見的臨床表現包括從輕微的關節(jié)腫脹到嚴重的進行性的骨及軟骨破壞的多關節(jié)炎。同其他自身免疫性疾病相似,女性比男性更加易感。RA的發(fā)病過程還不是完全明確,除了感染,激素和環(huán)境因素等原因,一些證據表明RA與遺傳因素有關。研究表明RA發(fā)病的一致性在同卵雙生子(15%)遠高于異卵雙生子(3.6%),RA的遺傳因素占50%～60%,提示患者的遺傳背景在RA發(fā)病過程中起重要作用[1]。

環(huán)氧合酶(COX)又稱為環(huán)氧化酶和前列腺素(PG)內過氧化物合成酶。COX的主要功能是將花生四烯酸轉變成PG,PG參與體內的許多生理和病理過程。COX家族主要有兩個亞型,分別是COX-1和COX-2。環(huán)氧合酶在許多生物進程中起重要作用,包括免疫功能和炎癥、細胞增殖、血管生成等,與 RA發(fā)病過程有關。PG和COX-2在炎癥過程中起重要作用,COX-2同時表現出炎癥前體細胞因子或抗炎特性,COX-2抑制劑現在被用來治療RA[2-3]。許多研究發(fā)現個體對RA的發(fā)生有易感性,與個體遺傳差異有關,因此可以進行COX-2基因多態(tài)性與RA發(fā)生易感性的研究。本研究以MALDI-TOF MS技術,進行以醫(yī)院為基礎的病例-對照研究,探討COX-2單核苷酸多態(tài)性與發(fā)生危險因素的相關性,以及NSAID藥物的臨床療效,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2010年9月～2011年4月在常州第二人民醫(yī)院、常州第一人民醫(yī)院和常州市中醫(yī)院收集的RA患者214例,RA患者均符合1987年美國風濕病學會(ACR)修訂的RA分類標準[4]。對照組478例,為同一時期在上述3家醫(yī)院住院的非免疫性疾病患者,主要為外傷性疾病。所有對象來自江蘇省常州市及其周邊地區(qū),均為漢族人群。2組年齡、性別差異均無顯著性(P>0.05)。其中有60例的RA患者給予NSAID藥物治療,并進行了詳細的隨訪。

1.2 方法

1.2.1 分析基因多態(tài)性:在獲得書面的知情同意書后,對RA患者及對照均使用特定的調查表進行問卷調查,空腹采集2 mL EDTA抗凝血,1 h內用4 000 r/min離心 10 min,分離白細胞層,采用Qiagen DNA提取試劑盒提取DNA。SNP分型采用美國 Sequenom公司的 MassARRAYTM Analyzer技術平臺進行SNP檢測。PCR引物和單堿基延伸引物均由Assay Designer 3.1軟件包設計。引物合成后,所有DNA樣本稀釋到30～50 ng/μ L,取 1 μ L,將其與 1.8 μ L 水 、0.5 μ L 10×PCR 緩沖 液 、0.4 μ L MgCl2 、0.1 μ L dNTP 、1 μ L PCR 引 物以及 0.2 μ L HotStar Taq 酶(Qiagen)混合在一起。PCR反應條件:95℃,2 min;95℃,30 s;56℃,30 s;72℃,1 min;共45個循環(huán);最終 72℃5 min,降溫至 25℃。PCR擴增后,剩余的dNTP將被去磷酸消化掉,反應體系包括 1.53 μ L 水 、0.17 μ L SAP 緩沖液 、0.3 U 堿性磷酸酶。該反應在37℃進行40 min,然后85℃,5 min使酶失活;降溫至25℃。堿性磷酸酶處理后,針對SNP的單堿基延伸引物在下列反應體系中進行 :0.619 μ L 水 、0.2 μ L 10×iPLEX 緩沖液 、0.2 μ L 終止混合物 、0.041 μ L iPLEX 酶,0.94 μ L的延伸引物。單堿基延伸反應在下列條件下進行:94℃,30 s;94℃,5 s;52℃,5 s;80℃,5 s;5個內部循環(huán);72℃,3 min。共40個外部循環(huán);降溫至25℃。最后在終止反應物中加入6 mg陽離子交換樹脂脫鹽,混合后加入25 μ L水懸浮。使用 MassARRAY Nanodispenser將最終的分型產物點樣到一塊384孔的 spectroCHIP(Sequenom)上,并用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀進行分析。最終結果由MassARRAYRT軟件系統(tǒng)實時讀取,并由 MassARRAY Typer 4.0軟件系統(tǒng)完成基因分型分析,見圖1。10%的樣本接受重復檢測,以驗證檢測的準確度。計算COX-2多態(tài)性位點變異基因型與野生型純合型致RA的相對風險度。

圖1 RACOX-2 rs5275多態(tài)性位點MALDI-TOF MS基因分型圖

1.2.2 用藥:60例使用NSAID藥物的 RA患者,用藥3月后調查藥物療效,檢查使用藥物前后壓痛和腫脹的關節(jié)數,實驗室測量使用藥物前后患者的血沉,并進行DAS28評分。

2 結 果

2.1 一般情況比較

本研究包含有214名 RA患者和380名對照,其中有60例患者使用NSAID藥物,RA患者平均年齡(54.63±15.77)歲,對照(54.84±10.45)歲,RA患者中有28.5%患者為男性,對照中有25.3%為男性。年齡與性別構成無顯著性差異,分析遺傳多態(tài)性P值分別為0.859和0.378。顯示年齡性別匹配較好,見表1。

2.2 遺傳平衡檢驗

對照人群的COX-2位點基因型經過Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗,P值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P=0.131),說明該人群COX-2位點基因型頻率處于平衡狀態(tài),具有群體代表性。

2.3 COX-2位點基因型分布與RA易感性關系

在單個位點的分析中,作者發(fā)現RA病例和對照中COX-2多態(tài)性位點頻率無明顯差異。在COX-2位點中,Logistic回歸發(fā)現與攜帶COX-2 T T基因型的個體相比較,攜帶COX-2 CC等位基因型與RA的發(fā)病風險無明顯相關(OR=1.17,95%CI=0.53～2.54);Logistic回歸發(fā)現隱性模型中相對于T T+TC基因型,攜帶CC基因型與RA的發(fā)病風險無明顯統(tǒng)計學差異(OR=1.08,95%CI=0.50～2.34)。見表2。

表1 RA病例及對照的基本信息( x±s)

表2 C OX-2 rs5275多態(tài)性和RA危險關系的Logistic回歸分析[n(%)]

2.4 NSAID藥物治療效果的比較

分析NSAID藥物使用前后的療效,治療前DAS28評分為(6.06±1.10),治療后 3個月DAS28評分為(4.67±1.06),DAS28評分明顯降低(P<0.01),表明NSAID藥物治療具有顯著的臨床療效。

3 討 論

在本病例對照研究中,研究了中國人群中COX-2 rs5275多態(tài)性位點和RA的關系,發(fā)現COX-2 rs5275多態(tài)性可能與RA發(fā)病危險性無關。同時本研究證明NSAID藥物治療RA具有顯著的臨床療效。炎癥反應是RA的發(fā)病的重要的分子機制之一,另一重要機制是刺激因素誘導了核內基因表達的改變,從而誘發(fā)滑膜細胞的增殖。COX可以催化使游離的花生四烯酸轉化為前列腺素H2(前列腺素的前體)、前列環(huán)素和血栓素[5]。前列腺素E2是RA中關鍵的影響關節(jié)的炎性介質,前列腺素E2除介導疼痛和炎癥外,前列腺素E2升高可導致關節(jié)和骨的侵蝕[6]。前列腺素E2的產生與對代謝性刺激物(例如炎癥細胞因子前體、脂多糖等)的反應導致的COX-2(炎性區(qū)域前列腺素 E2產生的限速酶)升高有關[7-8]。

COX-2表達也可由轉錄因子如核因子κ-B(NF-κ B)誘導,隨后,COX-2活化可能通過活化過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPAR-γ)及改變膜屏障功能從而抑制NF-κ B[9-10]。之前的研究發(fā)現COX-2 rs5275可能與韓國人群中顱內出血易感性無關,但與非小細胞肺癌放療后毒性有關[11-12]。但本研究未發(fā)現COX-2 rs5275多態(tài)性與RA易感性有關。

本研究對照基因型符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P=0.131),說明對照人群選擇具有代表性。NSAID類藥物對RA療效顯著,但也要注意它們的不良反應,非選擇的NSAID類藥物具有較強的胃腸道反應和腎毒性,選擇性的COX-2抑制劑雖然胃腸道反應小,其臨床療效亦降低,同時可增加心腦血管疾病的發(fā)病風險。

本研究存在以下不足:①本研究以醫(yī)院為基礎的病例對照研究,不可能完全排除選擇偏倚,需要進行大樣本的以人群為基礎的病例對照研究以闡明COX-2 rs5275多態(tài)性與 RA危險性關系;②盡管本研究樣本數量為214例RA和478例對照,但本研究的樣本量仍然不能完全發(fā)現頻率較低的變異與RA危險性關系;③需要進行COX-2 rs5275多態(tài)性功能學的研究,需要在以后的研究中進一步闡明功能學的相關性,以及進行藥物遺傳學方面的研究,如COX-2選擇性抑制類NSAID藥物的遺傳相關性等。

[1] Peng S,Duggan A.Gastrointestinal adverse effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs[J].Expert Opin Drug Saf,2005,4(2):157.

[2] Okayama M,Hayashi S,Aoi Y,et al.Aggravation by selective COX-1 and COX-2 inhibitors of dextran sulfate sodium(DSS)-induced colon lesions in rats[J].Dig Dis Sci 2007,52(9):2095.

[3] Sheibanie A F,Yen J H,Khayrullina T,et al.The proinflammatory effect of prostaglandin E2 in experimental inflammatory bowel disease is mediated through the IL-23-IL-17 axis[J].J Immunol 2007,178(2):8138.

[4] Arnett F C,Edworthy S M,Bloch D A,et al.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum 1988,31(3):315.

[5] Rouzer C A,Marnett L J.Cyclooxygenases:structural and functional insights[J].J Lipid Res,2009,50(Suppl):S29.

[6] 范雪嬌,仇小強,余紅平,等.COX-2基因單核苷酸多態(tài)性與肝細胞癌關聯(lián)的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(6):405.

[7] 李玉生.潰瘍性結腸炎患者血清PGE2、PAF水平變化及其臨床意義[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2010,14(11):17.

[8] 姜林娣,王漢洲,趙風娣,等.RNAi抑制類風濕關節(jié)炎成纖維細胞環(huán)氧合酶-2合成及對炎癥因子的影響[J].中華風濕病學雜志,2007,11(5):275.

[9] Scher J U,Pillinger M H.The anti-inflammatory effects of prostaglandins[J].J Investig M ed,2009,57(6):703.

[10] Wallace JL.COX-2:a pivotal enzyme in mucosal protection and resolution of inflammation[J].ScientificWorldJournal,2006,6:577.

[11] Kim D H,Ahn W Y,Kim D K,et al.A Promoter polymorphism(rs17222919,-1316T/G)of ALOX5AP is associated with intracerebral hemorrhage in Korean population[J].Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids,2011,85(3-4):115.

[12] Hildebrandt MA,Komaki R,Liao Z,et al.Genetic variants in inflammation-related genes are associated with radiation-induced toxicity following treatment for non-small cell lung cancer[J].PLoS One,2010,5(8):e12402.