呂俊明,左安華,王永振,張瀛丹,程 宏

(1.江蘇省儀征市人民醫(yī)院腫瘤科放療科,江蘇揚州,211400;2.揚州大學醫(yī)學院,江蘇揚州,225001)

桂皮酸的抗腫瘤作用首次見于1995年 Liu等[1]的報道,桂皮酸在體外能抑制肺癌、肝癌、前列腺癌、惡性膠質瘤、黑色瘤細胞的增殖和促進其分化。綜合近幾年的國內(nèi)外研究表明[2-5],桂皮酸具有廣泛的抗實體瘤活性,包括黑色素瘤、激素難治性前列腺癌、肺癌、膠質細胞瘤、肝癌、白血病等,它對腫瘤細胞具有抑制其生長增殖、誘導其分化的作用,而且其衍生物亦具有抗腫瘤活性[6-7]。本課題組前期研究結果表明,Ndfip1在某些腫瘤細胞中隨著其表達量的升高,腫瘤細胞凋亡率升高,說明Ndfip1可能對腫瘤細胞的凋亡產(chǎn)生促進作用。根據(jù)桂皮酸具有的抗腫瘤作用及Ndfip1可能促進腫瘤細胞凋亡作用的研究結果,本課題通過采用桂皮酸單獨作用及與Ndfip1聯(lián)合作用來研究其對人類肝癌細胞SMMC-7 721細胞增殖及凋亡的影響,為進一步探討其作用機理做初步嘗試,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

293T細胞株由中科院上海細胞所惠贈。SMMC-7 721人肝癌細胞株由揚州大學中西醫(yī)結合研究所提供。DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清等購自Hyclone公司。MTT試劑盒購自Invitrogen公司。桂皮酸購自Alfa Aesar化學產(chǎn)品有限公司。PI-Annexin細胞凋亡試劑盒購自南京凱基公司?？煽乇磉_的Ndfip1慢病毒載體由本室構建。轉染試劑盒購自QIAGEN公司。4HT(tamoxifen)等試劑購自Sigma公司。Ndfip1抗體由墨爾本大學Jason惠贈。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):293T細胞株及SMMC-7 721人肝癌細胞株培養(yǎng)于含10%的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對數(shù)生長期用于實驗。

1.2.2 慢病毒的包裝與感染:按照QIAGEN公司試劑盒的操作程序,在293T細胞中包裝含Ndfip1基因的慢病毒,并轉染SMMC-7 721細胞,經(jīng)嘌呤霉素與潮霉素篩選獲得穩(wěn)定轉染的細胞株,經(jīng)Western blotting鑒定,該細胞株是否為可控表達Ndfip1基因的細胞株。

1.2.3 免疫印跡:收集細胞,經(jīng)裂解液裂解細胞,收獲上清液并經(jīng) Lowry′s法測定蛋白濃度。樣品經(jīng)過SDS-PAGE后轉移到PVDF膜,用含有5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h,用封閉液稀釋的兔抗人Ndfip1抗體室溫封閉膜2～3 h,洗滌后將膜于封閉液稀釋的HRP-抗兔抗體溶液中室溫放置2～3 h,經(jīng)TBST洗膜后在ECL反應液中反應1 min,暗室顯影。

1.2.4 桂皮酸及Ndfip1對細胞生長的干預:桂皮酸使用時用0.1%DMSO(二甲基亞砜)溶解于10%胎牛血清的DMEM 后,用 0.45 μ m的一次性濾器過濾后配成不同濃度培養(yǎng)細胞,同時設Ndfip1表達與不表達的對應組細胞,陰性對照組為0.1%含DMSO、10%FBS的DMEM 培養(yǎng)液,細胞培養(yǎng)于96孔板。培養(yǎng)時間根據(jù)需要分別為12 h、24 h及 48 h等。

1.2.5 MTT實驗:干預結束后,每孔加入MTT溶液20 μ L,注意避光操作,放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)作用4 h。取出96孔板,將孔內(nèi)液體吸出后,加入150 μ L DMSO溶解紫色結晶。將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱5 min后,置于搖床5 min,轉速為80 r/min,酶標儀測定OD490值。

1.2.6 流式細胞術測定細胞凋亡:收集細胞1×106/mL,各自加入凋亡試劑盒中的緩沖液500 μ L重懸細胞,按要求加入PI、Annexin V,每孔各加10 μ L。室溫避光放置5～15 min后,立即行流式細胞儀測定實驗結果。

2 結 果

2.1 鑒定可控表達Ndfip1基因的SMMC-7721細胞株

經(jīng)過包裝好的病毒感染以及抗生素篩選,獲得了多個穩(wěn)定轉染Ndfip1的SMMC-7 721細胞克隆,加入或不加4HT培養(yǎng)24 h后裂解細胞,經(jīng)過Western blotting分析,發(fā)現(xiàn)Ndfip1可以在加入4HT后進行大量表達,而不加4HT則不會表達,實現(xiàn)了可控表達的目的,見圖1。

圖1 可控表達Ndfip1基因的SMMC-7 721細胞克隆的鑒定

2.2 桂皮酸單獨作用或與Ndfip1聯(lián)合作用對SMMC-7 721細胞增殖抑制率的影響

桂皮酸能有效抑制人肝癌細胞株SMMC-7 721細胞的生長,表現(xiàn)為桂皮酸與細胞間存在時間、劑量依賴性細胞毒效應關系,隨著桂皮酸濃度的增加,細胞增殖抑制率相應升高(圖2)。各時間組不同濃度兩兩比較,細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),各濃度組不同時間兩兩比較細胞增殖抑制率差異有顯著性,其中12 h組與24 h組比較0.5、1、4、8 mmol/L濃度時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),24h組與48h組比較0.5 、1、4、8 mmol/L 濃度時,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 不同濃度桂皮酸作用12、24、48 h對SMMC-7 721細胞增殖抑制率的影響

在使用4HT誘導Ndfip1表達后,桂皮酸與Ndfip1聯(lián)合作用能有效抑制細胞的生長,細胞增殖抑制率的改變與桂皮酸單獨作用相似,隨著桂皮酸濃度的增加,細胞增殖抑制率相應升高,見圖3。各時間組不同桂皮酸濃度兩兩比較細胞增殖抑制率,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);各濃度組不同時間兩兩比較細胞增殖抑制率,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),其中12 h組與24 h組比較0.5、2 、8、15 mmol/L 濃度時 ,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),1、4 mmol/L濃度時,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);24 h組與 48 h組比較 0.5、2、4、15 mmol/L濃度時,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),1、8 mmol/L濃度時,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 桂皮酸與Ndfip1聯(lián)合作用對SMMC-7 721細胞增殖抑制率的影響

桂皮酸與Ndfip1聯(lián)合作用對SMMC-7 721細胞增殖的抑制率明顯高于桂皮酸單獨作用,作用12、24及48 h后的相關結果都具有顯著性差異(P<0.01)。

2.3 桂皮酸單獨作用或與Ndfip1聯(lián)合作用對SMMC-7 721細胞凋亡的影響

桂皮酸能誘導人肝癌細胞株SMMC-7 721發(fā)生凋亡,且隨著濃度增加,細胞凋亡率也增加。與無藥組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);同時各濃度組間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。桂皮酸與Ndfip1聯(lián)合作用可使人肝癌細胞株7 721凋亡率明顯增加,與單獨使用桂皮酸相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4。

圖4 桂皮酸單獨及與Ndfip1聯(lián)合作用對人肝癌細胞株SMMC-7 721凋亡的影響

3 討 論

桂皮酸是從肉桂樹皮等植物中分離的單體化合物,是苯丙氨酸在植物組織內(nèi)的脫氨基產(chǎn)物,是調(diào)節(jié)植物細胞生長和分化的激素樣物質。國內(nèi)外研究表明,它具有廣泛的抗實體瘤活性。本實驗研究表明,不同濃度的桂皮酸作用于人肝癌細胞株SMMC-7 721時,能明顯抑制其增殖,且具有濃度與時間依賴性,有明顯統(tǒng)計學差異;通過流式細胞術檢測細胞凋亡表明,桂皮酸單獨作用于上述細胞時,能明顯促進其凋亡,其凋亡率具有時間與濃度依賴性,有明顯統(tǒng)計學差異。

Ndfip1蛋白是一種于 2000年通過 Farwestern被發(fā)現(xiàn)的跨膜蛋白,因其與Nedd4(neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated)蛋白特異結合而命名[8]。Nedd4蛋白與泛素化過程密切相關,是一種具有Hect(homologous to E6-AP Carboxyl terminus)結構域的E3泛素連接酶,可通過催化泛素與相關的靶蛋白結合而啟動該蛋白的降解程序[9-10]。實驗檢測發(fā)現(xiàn)Ndfip1蛋白在外傷區(qū)域周圍的殘存神經(jīng)細胞上有明顯高表達,同時伴隨其結合蛋白Nedd4表達數(shù)量增加,推測這兩種蛋白的高表達及結合后可能有助于在損傷神經(jīng)細胞中清除有害的錯誤折疊蛋白,促進神經(jīng)細胞的存活[11]。

本研究表明,桂皮酸與Ndfip1聯(lián)合作用于SMMC-7 721細胞時,其抑制增殖、促進凋亡的作用均較桂皮酸單獨作用升高,表明Ndfip1蛋白兼具對神經(jīng)細胞的保護作用及對其他腫瘤細胞的促凋亡作用,同時也表明桂皮酸與Ndfip1蛋白具有協(xié)同作用。

[1] Liu L,Hudgins W R,Shack S,et al.Cinnamic acid:A natural product with potential use in cancer intervention[J].Int J Cancer,1995,62(3):345.

[2] 朱文淵,劉 昆.桂皮酸和全反式維甲酸及維生素C對HL-60細胞的分化研究[J].中華腫瘤防治雜志,2006,13(8):592.

[3] Noda S,Miyazaki T,Tanaka T,et al.Production of Streptoverticillium cinnamoneum transglutaminase and cinnamic acid by recombinantStreptomyces lividans cultured on biomass-derived carbon sources[J].Bioresour Technol,2011,31:[Epub ahead of print].

[4] Kong Y H,Jo Y O,Cho C W,et al.Inhibitory effects of cinnamic acid on melanin biosynthesis in skin[J].Biol Pharm Bull,2008,31(5):946.

[5] Jitreanu A,Zbancioc A M,et al.Antimicrobial activity of some cinnamic acid derivatives[J].Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi,2011,115(3):965.

[6] Hussain M I,Reigosa M J.A chlorophyll fluorescence analysis of photosynthetic efficiency,quantum yield and photon energy dissipation in PSII antennae of Lactuca sativa L.leaves exposed to cinnamic acid[J].Plant Physiol Biochem,2011,49(11):1290.

[7] Lin D C,Shi Z Z,Xue L Y,et al.Expression of cell cycle related proteins cyclin D1,p53 and p21WAF1/Cip1 in esophageal squamous cell carcinoma[J].Yi Chuan,2010,32(5):455.

[8] Jolliffe C N,Harvey K F,Haines BP,et al.Identification of multiple proteins expressed in murine embryos as binding partners for the WW domains of the ubiquitin-protein ligase Nedd4[J].Biochem J,2000,351(Pt 3):557.

[9] 左安華,程 宏.Ndfip1蛋白的結構與功能[J].生命的化學,2009,29(5):649.

[10] Howitt J,Putz U,Lackovic J,et al.Divalent metal transporter 1(DMT1)regulation by Ndfip1 prevents metal toxicity in human neurons[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(36):15 489.

[11] Sang Q,Kim M H,Kumar S,et al.Nedd4-WW domain-binding protein 5(Ndfip1)is associated with neuronal survival after acute cortical brain injury[J].J Neurosci,2006,26(27):7234.