宋麗，劉友平（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，成都市611137；2.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都市 610083）

隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD），是美國的Williams和Welsh兩個研究小組于1990年同時提出的一種以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)，運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增，尋找多態(tài)性DNA片段的遺傳標(biāo)記技術(shù)，具有快速、簡便、成本低、DNA用量少、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[1]。

花椒（Zanthoxyli Pericarpium）為蕓香科花椒屬植物青椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.）或花椒（Z.bungeanumMaxim.）的干燥成熟果皮，具有“溫中止痛，殺蟲止癢”的功效[2]。花椒為川產(chǎn)道地藥材，甘孜、阿壩、涼山州等地均有栽培，但各地藥材質(zhì)量存在差異[3]，因此有必要研究不同產(chǎn)地花椒與青椒的遺傳多樣性，為花椒的鑒定、選種提供依據(jù)。由于目前還未見有關(guān)花椒與青椒RAPD-PCR分析方面的報道，因此本文所建立的反應(yīng)體系可為花椒與青椒的遺傳多樣性研究打下良好基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MyCycler型梯度PCR儀、Geldoceq型紫外凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）；TGL-16G型高速離心機(jī)（上海嘉鵬科技有限公司）；HB-100型恒溫金屬浴（杭州博日科技有限公司）；DYY-Ⅲ2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠）；MDF-U50V型超低溫冰箱（日本Sanyo公司）。

1.2 試藥

花椒采自四川省內(nèi)花椒（Z.bungeanumMaxim.）、青椒（Z.schinifoliumSieb.et Zucc.）的嫩葉或嫩芽。花椒的產(chǎn)地見表1。樣品采集后，立即裝入放有干燥劑變色硅膠的封口袋內(nèi)，于4℃貯藏，備用。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、核糖核酸酶A（RNase A）、瓊脂糖、DNA Maker DL 15 000、三磷酸脫氧核糖核苷酸（dNTPs）、Taq聚合酶、DNA Maker DL 2000（大連寶生物工程有限公司）；隨機(jī)引物（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巰基乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、氯化鈉（成都市科龍化工試劑廠）。

表1 花椒的產(chǎn)地Tab 1 The habitat of Zanthoxyli.pericarpium

2 方法與結(jié)果

2.1 DNA的提取

采用CTAB法提取總DNA。取樣品約50 mg，加入少量石英砂和PVP粉，于－80℃超低溫冰箱中放置過夜?？焖傺心コ杉?xì)粉，轉(zhuǎn)移到干凈滅菌的1.5 mL Eppendorf（EP）管中，加入65℃預(yù)熱的3%CTAB緩沖液700 μL和β-巰基乙醇50 μL，混勻，置65℃金屬浴中，約10 min震蕩1次。冷至室溫，加等體積的氯仿-異戊醇（24∶1）抽提2次，每次抽提后10 000 r·min-1離心10 min，將水相轉(zhuǎn)移到另一干凈滅菌的1.5 mL EP管中。加入1/2體積5 mol·L-1的NaCl溶液和等體積預(yù)冷至－20℃的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置于－20℃冰箱中沉淀1 h。10 000 r·min-1離心10 min，小心傾去上清液，用70%乙醇50 μL洗滌2次，每次洗滌后10 000 r·min-1離心2 min，倒置于濾紙上自然干燥1 h。加入50 μL ddH2O，置于37℃金屬浴中0.5 h溶解。加入1 μg·μL-1的RNase A 2 μL，置于37 ℃金屬浴中水解1 h。冷至室溫，4℃貯藏，備用。

考察提取時間30、45、60 min，均可獲得足夠的DNA用于PCR，故采用提取時間為30 min。DNA提取時間的優(yōu)化見圖1。

圖1 DNA提取時間的優(yōu)化Fig 1 The optimization of DNAextracting time

2.2 DNA的檢測

采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA。取DNA樣品5 μL，與6×Loading Buffer 1 μL混勻后點(diǎn)于凝膠孔中，與3 μL DNA Maker DL 15 000同置1×TAE緩沖液中，于100 V電壓下電泳，紫外成像檢測。

2.3 PCR體系

考察MgCl2、dNTPs、引物、模板DNA和Taq酶5個因素，每個因素取4個濃度水平，采用正交設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化。因素水平見表2；正交試驗結(jié)果見表3。

表2 因素水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗結(jié)果Tab 3 Results of orthogonal experiment

11號試驗方案可獲得清晰、穩(wěn)定的PCR擴(kuò)增條帶，故在25 μL反應(yīng)體系中應(yīng)加入ddH2O 13.5 μL、25 mmol·L-1的 MgCl22.0 μL、2.5 mmol·L-1的 dNTPs 2.0 μ L、10 ×Buffer 3.0 μL、10 ng·μL-1的引物2.0 μL、模板DNA2.0 μL和 5 IU Taq 酶 0.5 μL。PCR體系的優(yōu)化見圖2。

圖2 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化Fig 2 The optimization of PCR reaction system

圖3 退火溫度的優(yōu)化Fig 3 The optimization of renaturation temperature

圖4 循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化Fig 4 The optimization of circulation number

2.4 PCR程序

考察退火溫度和循環(huán)次數(shù)，43.8℃的退火溫度和45次循環(huán)可獲得清晰、穩(wěn)定的PCR擴(kuò)增條帶，故PCR程序為95℃預(yù)變性3 min，94℃預(yù)變性2 min，94℃變性50 s，43.8 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min 20 s，45 個循環(huán)，72℃最后延伸5 min。退火溫度的優(yōu)化見圖3；循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化見圖4。

2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

采用1.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。取擴(kuò)增產(chǎn)物 5.0 μL，與 6×Loading Buffer 1.0 μL混勻后點(diǎn)于凝膠孔中，與 3.0 μL DNA Maker DL 2 000同置1×TAE緩沖液中于100 V電壓下電泳，紫外成像檢測。

2.6 RAPD-PCR體系的穩(wěn)定性考察

按“2.3”、“2.4”項下方法操作，對表1中的花椒樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均可獲得清晰、穩(wěn)定的PCR擴(kuò)增條帶?；ń放c引物TGCTCTGCCC擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見圖5。

3 討論

圖5 花椒與引物TGCTCTGCCC擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖Fig 5 Electrophoretogram of amplified products of Zanthoxyli Pericarpium and primer TGCTCTGCCC

花椒中的雜質(zhì)如多糖、多酚、蛋白質(zhì)等會影響DNA的提取、純化以及PCR擴(kuò)增，因此筆者以往參考文獻(xiàn)[4]采用改良的CTAB法提取DNA，并加入石英砂增加植物細(xì)胞壁的破碎，加入氯仿-異戊醇（24∶1）抽提蛋白質(zhì)，加入PVP、β-巰基乙醇和 5 mol·L-1的 NaCl除去多糖、多酚等雜質(zhì)[4，5]。此外，由于RAPD反應(yīng)對DNA的質(zhì)量要求不高，因此在加入少量Rnase酶除去RNA后，不再抽提蛋白質(zhì)，試驗證明，這樣可減少DNA的損失，并且不影響PCR擴(kuò)增。

RAPD反應(yīng)的影響因子較多，反應(yīng)體系中Mg2+、dNTP、模板DNA、引物，Taq聚合酶等的濃度直接影響著試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，若是每項一一考察，不僅操作煩瑣，而且耗費(fèi)大量的時間和試驗經(jīng)費(fèi)，因此本文采用正交試驗考察各影響因子，大大簡化了試驗過程，節(jié)約了時間和經(jīng)費(fèi)。此外，PCR的各成分之間的濃度比例是一個動態(tài)過程，反應(yīng)體系中改變某成分的濃度時相應(yīng)改變其他成分的濃度才能有效擴(kuò)增，因此通過正交試驗可得到多種有效組合，有利于根據(jù)試劑情況選用不同的組合[6]。

[1] 白 音，包英華，王文全，等.美花石斛RAPD-PCR反應(yīng)體系的建立[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（3）：521.

[2] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：149.

[3] 徐國鈞，徐珞珊，王崢濤.常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究（第3冊）[M].福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，2001：532.

[4] 童巧珍，周日寶，劉湘丹，等.藥用百合鱗葉中總DNA提取方法的研究[J].中國藥房，2008，19（6）：406.

[5] 王 婷，李愛賢，郭慶梅，等.忍冬葉片基因組DNA的提取與分析[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，32（3）：247.

[6] 李勁平，王培訓(xùn).正交設(shè)計在RAPD-PCR條件優(yōu)化中的應(yīng)用[J].中藥新藥與臨床藥理，2004，15（4）：265.