梁學(xué)政，陳惠紅，唐勇琛，陸玉婷，覃紅（.廣西柳州市中醫(yī)院，柳州市54500；.廣西中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院008級研究生，南寧市 5000；.廣西中醫(yī)學(xué)院007級藥學(xué)本科，南寧市 5000）

正交試驗(yàn)優(yōu)選弱視明口服液的提取工藝Δ

梁學(xué)政1＊，陳惠紅1，唐勇琛1，陸玉婷2，覃紅3（1.廣西柳州市中醫(yī)院，柳州市545001；2.廣西中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院2008級研究生，南寧市 530001；3.廣西中醫(yī)學(xué)院2007級藥學(xué)本科，南寧市 530001）

目的：篩選弱視明口服液的最佳提取工藝。方法：采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總多糖含量、總多糖的轉(zhuǎn)移率、出固率的綜合評分為指標(biāo)，以加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)為考察因素，優(yōu)選煎煮工藝；以濃縮液相對密度、醇沉濃度、靜置時(shí)間為考察因素，優(yōu)選醇沉工藝。結(jié)果：最佳提取工藝為煎煮3次，第1次1.5h，加8倍水；第2、3次分別為1.0、0.5h，加5倍水；濃縮液相對密度為1.15，醇沉濃度為50%，靜置時(shí)間16h。結(jié)論：該工藝簡便，制成成品質(zhì)量穩(wěn)定。

弱視明口服液；正交試驗(yàn)；煎煮工藝；醇沉工藝

弱視明口服液是廣西柳州市中醫(yī)院通過臨床實(shí)踐研制出的純中藥制劑，由熟地黃、黃精、枸杞子、陳皮等中藥組成，具有益腎填精、養(yǎng)肝明目、開竅寧神之功效，用于兒童神經(jīng)發(fā)育不良，近視、遠(yuǎn)視、散光等造成的弱視?，F(xiàn)代藥理證明，熟地黃多糖具有滋陰、益智、增強(qiáng)人體造血機(jī)能、調(diào)節(jié)免疫等作用；黃精多糖具有調(diào)節(jié)血糖、提高人體免疫功能、抗疲勞等功效；枸杞子多糖具有提高人體免疫功能、降糖降脂、抗疲勞、抗衰老、保肝等功效[1]；而多糖為該制劑主要有效成分。為了更好的控制其質(zhì)量，為制備工藝提供科學(xué)依據(jù)，本課題組采用苯酚-硫酸法測定處方中總多糖（以葡萄糖計(jì)）的含量，同時(shí)還結(jié)合總多糖的轉(zhuǎn)移率、出固率作為提取工藝綜合評價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法對提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)考察，以篩選出最佳工藝。

1 儀器與試藥

CAL204電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；UV-1601紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；KR80-2沉淀離心機(jī)（上海分析儀器廠）；KDM可調(diào)控溫電熱套（山東鄄城科源儀器設(shè)備廠）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；HP-01無油真空泵（上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠）。

D-無水葡萄糖對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110833-200904）；熟地黃、黃精、陳皮飲片（廣西貴港市綠之源種養(yǎng)發(fā)展有限公司，批號均為100601）；枸杞子（廣西一致中藥飲片有限公司，批號：20100611）；石菖蒲飲片（廣西柳州百草堂藥業(yè)有限公司，批號：20100423）；楮實(shí)子飲片（廣西萬豐藥業(yè)有限公司，批號：20100225）；5%的苯酚溶液（取苯酚分析純100g，加鋁片0.1g、碳酸氫鈉0.05g混合，常壓蒸餾，收集182℃餾分。稱取該餾分5.0g，置于100mL容量瓶中，加新鮮蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后置棕色試劑瓶中，即得，冷藏、避光保存）由柳州市中醫(yī)院藥劑科自制；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 煎煮工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[2]，以加水量（A）、煎煮時(shí)間（B）、煎煮次數(shù)（C）為考察因素，以總多糖含量、總多糖轉(zhuǎn)移率、出固率的綜合評分為評價(jià)指標(biāo)，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。提取工藝的因素水平見表1。

2.2 煎煮樣品液的提取

將處方中各藥材粉碎成粗粉，按比例稱取適量，根據(jù)表1的安排加水煎煮提取，煎煮前用規(guī)定量水浸泡20min。煎煮液用紗布濾過后濃縮至170mL，冷卻后置于冰箱（7℃）冷藏，即得9份煎煮液，備用。

2.3 總多糖含量測定

2.3.1 葡萄糖對照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品40.4mg，置于100mL的量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.404mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取葡萄糖對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分別置于25mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。分別精密量取以上溶液各2.0mL，置于具塞試管中，加5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速沿壁加入濃硫酸5.0mL，混勻，40℃水浴加熱20min，置于冷水浴中冷卻至室溫。用分光光度法在490nm波長處測定吸收度（另用純化水隨行做空白）。以葡萄糖濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝15.571X+0.026（r＝0.9998）。結(jié)果表明，葡萄糖檢測濃度在0.00808～0.04848mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.3.3 測定波長的選擇 參考文獻(xiàn)方法[5]，以蒸餾水為空白，按“2.3.2”項(xiàng)下方法試驗(yàn)，于280～600nm波長范圍內(nèi)掃描，葡萄糖對照品在490.0nm波長處有最大吸收，故選擇490.0nm為最大吸收波長。

2.4 煎煮工藝優(yōu)選

精密量取“2.2”項(xiàng)下煎煮液10.0mL，置于50mL量杯中，攪拌下緩慢加入95%乙醇使含醇量達(dá)50%，冷藏，靜置過夜，過濾，用50%乙醇10mL洗滌2次，取濾液回收乙醇至無醇味，再置于水浴濃縮至稠膏狀，加80%乙醇20mL分次溶解，搖勻，離心，傾出上清液，沉淀用80%乙醇洗滌2次，收集沉淀物體，加水溶解，轉(zhuǎn)移并定容至100mL量瓶中。精密吸取該溶液5.0mL于25mL量瓶中，定容，作為供試品溶液。精密吸取該供試品溶液2.0mL，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，測定總多糖含量。并按下式計(jì)算總多糖含量的百分比、總多糖轉(zhuǎn)移率、出固率以及綜合評分：總多糖含量的百分比＝總多糖含量×供試品溶液總體積/供試品溶液總體積×供試品溶液密度?？偠嗵寝D(zhuǎn)移率＝總多糖含量×供試品溶液總體積/處方中藥材總多糖的量；出固率＝供試品干浸膏量/處方總藥材量；綜合評分＝總多糖含量的百分比×0.2+總多糖轉(zhuǎn)移率×0.6+出固率×0.2。煎煮工藝正交試驗(yàn)結(jié)果見表2；煎煮工藝方差分析結(jié)果見表3。

由表2、表3可知，因素B、C對煎煮工藝的影響極顯著，因素A的影響也具有顯著性，影響程度依次為B＞C＞A，因而確定最佳煎煮工藝為A2B2C3，即煎煮3次，第1次1.5h，加8倍水；第2、3次分別為1.0、0.5h，加5倍水。

2.5 醇沉工藝研究

2.5.1 醇沉工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)以濃縮液相對密度（A）、醇沉濃度（B）、靜置時(shí)間（C）為考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)法對醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)化。醇沉工藝因素水平見表4。

2.5.2 醇沉樣品溶液的制備 根據(jù)最佳煎煮工藝制備9份煎煮液，分別濃縮至相對密度為1.05、1.10、1.15，冷卻后邊攪拌邊緩慢加入95%的乙醇，使含醇量分別達(dá)到50%、60%、70%。然后按要求靜置不同時(shí)間，抽濾，棄去沉淀，取濾液回收乙醇，然后濃縮至比重為1.06，即得9份樣品溶液。

2.5.3 醇沉工藝的優(yōu)選 精密量取醇沉樣品溶液適量，按“2.4”項(xiàng)下方法計(jì)算總多糖轉(zhuǎn)移率、出固率以及綜合評分，并以此為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選醇沉工藝。醇沉工藝正交試驗(yàn)結(jié)果見表5；醇沉工藝方差分析結(jié)果見表6。

由表5、表6可知，因素A、B對醇沉工藝的影響有極顯著性，而因素C無影響，其影響程度依次為A＞B＞C。為了縮短生產(chǎn)時(shí)間，確定最佳醇沉工藝為A3B1C2，即濃縮液相對密度為1.15，醇沉濃度為50%，靜置時(shí)間16h。

表1 提取工藝的因素水平Tab 1 Factors and levels of extraction technology

表2 煎煮工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal experiment of decoction technology

表3 煎煮工藝方差分析結(jié)果Tab 3 Analysis of variance of decoction technology

表4 醇沉工藝因素水平Tab 4 Factors and levels of alcohol precipitation technology

3 討論

用苯酚-硫酸法測定總多糖含量，重現(xiàn)性和加樣回收率相對不穩(wěn)定，為了得到理想的結(jié)果，筆者考察了試驗(yàn)中葡萄糖對照液、苯酚、濃硫酸的加入比例，以葡萄糖對照液∶苯酚∶濃硫酸按0.5∶1∶5、1∶1∶5、2∶1∶53比例進(jìn)行反應(yīng)，然后對其回收率進(jìn)行考察，當(dāng)試劑加入比例為2∶1∶5時(shí)，回收率較高，且重現(xiàn)性較好。故確定試劑的加入比例為2∶1∶5。

有報(bào)道[3]，試驗(yàn)中濃硫酸的加入方法有垂直和沿壁加入，采用上述方法，以樣品的重復(fù)性和穩(wěn)定性為考察指標(biāo)，觀察濃硫酸加入法對結(jié)果的影響，沿壁加入法重復(fù)性較好，但是必須等待其反應(yīng)完全后（約20min）才能得出相對準(zhǔn)確的測量值。

試驗(yàn)樣品用80%乙醇處理，消除了親脂性雜質(zhì)、單糖、低糖及苷類成分的干擾，故可純化多糖。

表5 醇沉工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of orthogonal experiment of alcohol precipitation technology

表6 醇沉工藝方差分析結(jié)果Tab 6 Analysis of variance of alcohol precipitation technology

[1] 陳 曄，孫曉生.黃精的藥理研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21（3）：328.

[2] 潘林梅，陳 峰，薛博渝.正交設(shè)計(jì)優(yōu)選蘭豆顆粒的水提工藝研究[J].江蘇中醫(yī)藥，2003，24（11）：346.

[3] 李 輝，羅佳波.苯酚-硫酸法測定圍樂顆粒中總多糖的含量[J].中國藥房，2008，19（9）：685.

Optimization of the Extraction Technology of Ruoshiming Oral Solution by Orthogonal Design

LIANG Xue-zheng，CHEN Hui-hong，TANG Yong-chen（Liuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine of Guangxi Region，Liuzhou 545001，China）
LU Yu-ting（Postgraduate Student of Grade 2008，School of Graduate，Guangxi Traditional Chinese Medical University，Nanning 530001，China）
QIN Hong（Pharmacy Major of Grade 2007，Guangxi Traditional Chinese Medical University，Nanning 530001，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Ruoshiming oral solution.METHODS：An orthogonal test was adopted in this study.The decoction technology was optimized with the transfer and dry material rates of total polysaccharides as index and using amount of water，decoction time and times as factors.The alcohol precipitation technology was optimized using relative density of concentrate，alcohol precipitation concentration and deposit time as factors.RESULTS：The optimal extraction technology was as follows：the herb medicines were extracted for 3times，1.5hour with 8times of water for the first time，1.0hour with 5times for the second time；0.5hour with 5times for the third time.The optimal alcohol precipitation process was as follows：relative density of concentrate of 1.15，precipitation concentration of 50%，the alcohol deposit for 16hours.CONCLUSION：The technology is simple and preparation is stable in quality.

Ruoshiming oral solution；Orthogonal experiment；Decoction technology；Alcohol precipitation technology

R283.61；R284.2

A

1001-0408（2011）31-2914-03

Δ廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥醫(yī)院制劑類課題（GZYZ-10-39）

＊主任藥師。研究方向：中藥制劑、藥事管理。電話：0772-2309351。E-mail：lxuezheng@163.com

2011-03-21

2011-05-06）