王燕 褚漢啟 周良強(qiáng) 陳金 李志勇 劉云 張平 王春芳 黃孝文 崔永華

1 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(武漢430030);△現(xiàn)在武漢市婦幼兒童保健中心(武漢市兒童醫(yī)院)耳鼻咽喉頭頸外科

研究表明血管紋區(qū)域是轉(zhuǎn)運(yùn)K+進(jìn)入內(nèi)淋巴和產(chǎn)生耳蝸內(nèi)電位的重要部位[1,2],其中最主要的功能活性細(xì)胞邊緣細(xì)胞(marginal cell,MC)是內(nèi)淋巴產(chǎn)生和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵,并參與了蝸內(nèi)電位的形成和維持。KCNQ1為近年研究發(fā)現(xiàn)的分布于血管紋邊緣細(xì)胞膜上的三種轉(zhuǎn)運(yùn)K+的通道蛋白之一[1～3],已發(fā)現(xiàn)該通道蛋白功能異常與多種心律失常、遺傳性聾等疾病的發(fā)生有關(guān)[4],其在耳蝸內(nèi)主要分布于邊緣細(xì)胞,除參與并維持耳蝸K+循環(huán)的作用外[5],亦可認(rèn)為是邊緣細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白。由于內(nèi)耳結(jié)構(gòu)復(fù)雜及血管紋邊緣細(xì)胞包裹于骨性蝸殼中,取材困難,所以邊緣細(xì)胞在內(nèi)耳聽力相關(guān)性疾病中的病理生理作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用原代消化培養(yǎng)方法,建立成年小鼠血管紋邊緣細(xì)胞體外分離培養(yǎng)體系,為進(jìn)一步研究成年期邊緣細(xì)胞的生理特性、病理生理功能以及相關(guān)通道蛋白在耳蝸內(nèi)電位(endocochlear potential,EP)形成及K+循環(huán)中的作用和地位提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生75±3 d的健康C57BL/6J小鼠6只,體重30～35 g,雌雄不限,購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 MEM培養(yǎng)基(Hyclone)中加入15%胎牛血清(Gibco)、氫化可的松0.4 mg/L(Sigma)、表皮生長(zhǎng)因子10 ng/ml(Chenkon)、0.02%EDTA 、0.25%胰蛋白酶(Gibco)、膠原酶Ⅱ(invitrogen)。多聚賴氨酸(Sigma),兔抗小鼠角蛋白18(CK18)單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),兔抗小鼠KCNQ1多克隆抗體(Santa Cruz),羊抗兔IgG(SABC-cy3)試劑盒,羊抗兔IgG(SABC-FITC)試劑盒(武漢博士德)。Trizol(Invitrogen),RT-PCR試劑盒(Takara),CK18、KCNQ1及內(nèi)參β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血管紋邊緣細(xì)胞的分離、純化與培養(yǎng) 6只成年小鼠采用頸椎脫臼法處死,浸入裝有75%乙醇的燒杯中消毒5 min,移入冰凍PBS液中進(jìn)行解剖：斷頭,沿中線剪開顱骨,去除大腦及周圍組織,分離出雙側(cè)聽泡。在解剖顯微鏡下,分離出血管紋組織,將其剪成小塊狀轉(zhuǎn)移至離心管,加入0.2%Ⅱ型膠原酶于37℃培養(yǎng)箱消化30 min,然后 800 r/min離心5 min,棄上清,沉淀重懸于含15%胎中血清(FBS)的MEM 培養(yǎng)基中,收集細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至用多聚賴氨酸預(yù)先包被的六孔板中,加入適量完全培養(yǎng)基,置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。24 h后換液,以后每2天或視細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液。每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)的基本情況。采用選擇性消化法和差速貼壁法進(jìn)行細(xì)胞純化[6,7]。

1.3.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔體積200 μ l,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第1～15天隔日加入MT T溶液(5 g/L)20 μ l,37℃繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基,每孔加入 150 μ l DMSO,振蕩 10 min 后,以492 nm波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度(A)值。每組設(shè) 3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次,以不加細(xì)胞僅加培養(yǎng)基的孔為空白對(duì)照孔。以時(shí)間為橫軸,A值均值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定

1.4.1 透射電鏡觀察 取純化后的細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶消化,完全培養(yǎng)基終止消化,收集細(xì)胞懸液,800 r/min離心5 min,棄上清,2.5%戊二醛固定,常規(guī)制作透射電鏡標(biāo)本并觀察。

1.4.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞角蛋白18(CK18)和KCNQ1的表達(dá) 取純化后的細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定30 min,0.01 mol/L PBS溶液洗3 min×3次;0.25%tritonⅩ-100破膜 15 min,5%BSA封閉 20 min,分別加 CK18(1∶100)、KCNQ1(1∶200)抗體,4℃濕盒過夜,室溫復(fù)溫30 min,PBS洗 3 min×3次,分別滴加cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶100),FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶100),室溫孵育60 min,PBS洗3 min×3次,DAPI染核,防淬滅劑封片,激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4.3 RT-PCR檢測(cè)CK18和KCNQ1 mRNA的表達(dá) 取純化后MC,PBS清洗去除培養(yǎng)液,按Trizol試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA,再逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系(20 μ l)：cDNA 1 μ l,Taq Mix 10 μ l,超純水7 μ l,上游引物 1 μ l,下游引物 1 μ l。CK18 的上游引物 ：5′-GATCAGGCAGCTGAGGACAGA-3′;下游引物：5′-TGAGCT TGGAGACCT TGGAT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為235 bp;KCNQ1擴(kuò)增的上游引物：5′-CGTGTACCACTTCACCGTCT T-3′,下游引物：5′-GAGGCGGACCACATATTCTG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 157 bp;內(nèi)參β-actin基因,上游引物 ：5′-CCGTGAAAAGATGACCCAG-3′,下游引物 ：5′-TAGCCACGCTCGGTCAGG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為249 bp。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性10 min,94℃變性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸1 min,共循環(huán)30次,72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察拍照,打印。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的MC生長(zhǎng)特性和形態(tài)特點(diǎn) 培養(yǎng)24～48 h后,在倒置顯微鏡下可見有細(xì)胞貼壁和增殖,呈不規(guī)則多角形,形成大小不等的“細(xì)胞島”(圖1);5～8天后,多角形細(xì)胞迅速生長(zhǎng),增殖快,以后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期,少量成纖維樣細(xì)胞在其外周生長(zhǎng);12～14天時(shí)大量增殖的細(xì)胞互相抵觸,緊密排列,形成上皮單層,呈上皮細(xì)胞典型的“鋪路石”樣外觀(圖2),并可見由數(shù)百個(gè) MC密集生長(zhǎng)組成的折光性強(qiáng)的球形結(jié)構(gòu)(dome);在培養(yǎng)第20天左右,細(xì)胞出現(xiàn)拉絲、拉網(wǎng)現(xiàn)象,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡。MC的生長(zhǎng)曲線見圖3。

2.2 培養(yǎng)細(xì)胞的電鏡觀察及KCNQ1通道蛋白的的表達(dá)情況 透射電鏡觀察可見細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器豐富,單核,呈卵圓形并可見分葉,細(xì)胞表面有較多微絨毛,細(xì)胞間連接緊密,符合上皮細(xì)胞特征(圖4);激光共聚焦檢測(cè)顯示培養(yǎng)的細(xì)胞CK18蛋白表達(dá)陽性(圖5),細(xì)胞胞質(zhì)可見紅色熒光,細(xì)胞核呈藍(lán)色;KCNQ1通道蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜上,呈綠色熒光(圖6);陰性對(duì)照細(xì)胞無著色,僅見藍(lán)色細(xì)胞核;對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞提取總RNA,OD260/OD280的比值為1.75,RT-PCR的產(chǎn)物：CK18為235 bp的片段,KCNQ1為157 bp的片段,β-actin為 249 bp(圖7、8)。

圖7 培養(yǎng)細(xì)胞的CK18mRNA RT-PCR電泳圖 M—marker;1-β-actin;2-CK18

圖8 培養(yǎng)細(xì)胞的KCNQ1mRNA RT-PCR電泳圖 M—marker;1-β-actin;2-KCNQ1

3 討論

耳蝸血管紋具有特殊的組織結(jié)構(gòu),血供豐富,由三層細(xì)胞和血管紋間隙(又稱紋間區(qū),intrastrial space,IS)組成,三層細(xì)胞分別為邊緣細(xì)胞(marginal cell,MC)、中間細(xì)胞(intermediate cell,IC)和基底細(xì)胞(basal cell,BC)。邊緣細(xì)胞緊鄰中階內(nèi)淋巴,以緊密連接蛋白相連接,不但參與K+向內(nèi)淋巴液的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),在形成內(nèi)淋巴高K+和維持耳蝸內(nèi)電位中起重要作用外,還參與內(nèi)外淋巴屏障的構(gòu)成。因邊緣細(xì)胞所在的血管紋位于耳蝸深處,且成年鼠耳蝸骨化明顯,血管紋分離取材更加困難,不利于對(duì)邊緣細(xì)胞的活體分離研究,而體外細(xì)胞培養(yǎng)可以克服這種缺點(diǎn),故本研究采用Ⅱ型膠原酶消化法體外分離培養(yǎng)成年小鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞。

與其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比,小鼠是目前世界上用于研究轉(zhuǎn)基因和基因敲除最多的動(dòng)物,尤其是敲基因和某些基因自然變異而導(dǎo)致的聽覺障礙與人類極為相似,因此小鼠逐漸替代豚鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廣泛應(yīng)用于聽覺系統(tǒng)的研究。1989年Rarey等首先報(bào)道應(yīng)用消化法成功培養(yǎng)了牛的耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞,此后,Kim等[8]報(bào)道用豚鼠、沙鼠和大鼠采用血管紋組織塊法培養(yǎng)出MC,并通過形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)和電生理學(xué)研究,初步觀察了培養(yǎng)的MC的結(jié)構(gòu)特征和功能特性,但未見小鼠血管紋邊緣細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道。在組織水平對(duì)MC的在體研究發(fā)現(xiàn),不同年齡段邊緣細(xì)胞的某些功能蛋白的表達(dá)有差異,如Na、K-ATPase在小鼠耳蝸的表達(dá)于出生后1個(gè)月才達(dá)到成熟水平[9],且其活性隨著鼠齡增加而逐步減退[10],血管加壓素受體V2在成年大鼠耳蝸未檢測(cè)到其表達(dá),而新生大鼠耳蝸則有表達(dá)[11]。本研究取材于成年小鼠,采用消化法建立耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞培養(yǎng)體系,旨在為進(jìn)一步研究成年期小鼠血管紋邊緣細(xì)胞的生理病理特性提供實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

由于耳蝸血管紋組織分離的困難性,目前邊緣細(xì)胞的培養(yǎng)主要采用組織塊貼壁法和胰酶消化法,組織塊貼壁法雖操作簡(jiǎn)單,但在邊緣細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí),亦有較多的雜質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等生長(zhǎng),影響邊緣細(xì)胞的成長(zhǎng)及純度;胰酶消化法是目前細(xì)胞培養(yǎng)研究中最常用的一種方法,但其消化作用較強(qiáng),對(duì)細(xì)胞成分和活性的影響大[12]。而本研究選用Ⅱ型膠原酶進(jìn)行血管紋邊緣細(xì)胞的原代消化培養(yǎng),其優(yōu)點(diǎn)在于Ⅱ型膠原酶作用溫和,有較好的細(xì)胞間質(zhì)消化功能,而上皮類細(xì)胞對(duì)其又具有一定的耐受性,可將上皮類細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)成分相分離而不損傷上皮類細(xì)胞。國(guó)外很多學(xué)者在原代培養(yǎng)上皮細(xì)胞的研究中,均應(yīng)用了胰島素、霍亂毒素、三碘甲狀腺原氨酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長(zhǎng)因子等成分促進(jìn)細(xì)胞體外生長(zhǎng),但價(jià)格昂貴。本研究中僅使用了MEM、FBS、表皮生長(zhǎng)因子成分,采用消化法仍培養(yǎng)出大量的MC,而且細(xì)胞代謝旺盛,生長(zhǎng)良好,免疫熒光檢測(cè)可見培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白CK18,且RT-PCR也檢測(cè)到培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CK18 mRNA,與其他研究者觀察到的邊緣細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)特征以及生物學(xué)特性一致,證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮來源的血管紋邊緣細(xì)胞。由于成纖維樣細(xì)胞相對(duì)較上皮類細(xì)胞容易貼壁[13],先吸附在瓶壁上,經(jīng)過多次貼壁選擇后,細(xì)胞懸液中剩下的主要是邊緣細(xì)胞,故在邊緣細(xì)胞的純化方面,本研究采用選擇性消化法和差速貼壁法,可使細(xì)胞的純度達(dá)到95%以上。

KCNQ1通道蛋白是一種電壓依賴性門控鉀通道蛋白,由位于染色體11p15.5的KCNQ1基因編碼,主要分布于內(nèi)耳、心臟、腎臟、胰腺和氣道等上皮細(xì)胞[5]。研究發(fā)現(xiàn)耳蝸KCNQ1通道可能是參與耳蝸K+循環(huán)的重要通道蛋白[14,15],可將邊緣細(xì)胞內(nèi)的K+分泌至內(nèi)淋巴,形成內(nèi)淋巴高K+環(huán)境。在耳蝸中KCNQ1通道僅表達(dá)于血管紋邊緣細(xì)胞的頂膜,是該膜的主要離子通道,因此可作為該細(xì)胞的獨(dú)特標(biāo)志物。若缺乏該通道將阻礙耳蝸血管紋轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子進(jìn)入內(nèi)淋巴,進(jìn)而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,最終造成聽力損失[16]。本實(shí)驗(yàn)采用Ⅱ型膠原酶消化法成功建立了成年小鼠耳蝸血管紋MC的體外分離培養(yǎng)體系,有利于對(duì)成年小鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞進(jìn)行病理、生理和分子生物學(xué)等方面的深入研究。

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