王志君，尤本明，孫華君，宋洪杰，劉繼勇 (第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

雷公藤(Tripterygium)為衛(wèi)茅科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f的根、葉及花，又名黃藤、斷腸草。性味辛涼，有大毒，入肝經(jīng)，兼入脾腎經(jīng)，其主要功能為清熱解毒、祛風(fēng)除濕、舒筋活血通絡(luò)、消腫止痛、殺蟲止癢。雷公藤多苷為雷公藤的主要活性成分，在臨床上多與其他藥物復(fù)方配伍應(yīng)用，目前上市的雷公藤制劑主要有雷公藤片、雷公藤雙層片、雷公藤多苷片等［1］。但由于其口服存在著較大的毒性反應(yīng)，因此限制了其臨床應(yīng)用［1，2］。微乳(microemulsion，ME)是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑按適當比例混和，自發(fā)形成的各向同性、透明、熱力學(xué)穩(wěn)定的分散體系。具有增加藥物的溶解度、提高藥物穩(wěn)定性、促進藥物透皮吸收、延長藥物作用時間等優(yōu)點，因此日益受到研究者的重視［3～6］。本文研究了用高效液相色譜法測定雷公藤微乳中雷公藤內(nèi)酯甲含量的方法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 LC-10A vp高效液相色譜儀(日本島津制作所，包括 LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外檢測器、CLASS vp色譜工作站和SCL-10Avp系統(tǒng)控制器);調(diào)溫調(diào)濕箱(上海實驗儀器廠有限公司，302A型);FA-2004電子天平(萬分之一，上海天平儀器廠);電子天平(十萬分之一，Sartorius);精密酸度計(上海天達儀器有限公司)。

1.2 試劑 雷公藤多苷原料藥(浙江得恩德制藥有限公司，雷公藤內(nèi)酯甲含量0.263%);雷公藤內(nèi)酯甲標準品(批號111597-200402，純度＞98%，中國藥品生物制品檢定所);Lecithin E200(德國Degussa公司);肉豆蔻酸異丙酯 (IPM，國藥集團化學(xué)試劑有限公司);烷基葡萄糖苷(APG，中國日用化學(xué)工業(yè)研究院);1，2-丙二醇(上海制藥有限公司);中性氧化鋁(上海五四化學(xué)試劑有限公司);甲醇和乙腈(HPLC級，Tedia公司);水為重蒸水;其他試劑為分析純。雷公微乳(自制，雷公藤多苷含量1.2%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取雷公藤內(nèi)酯甲對照品2 mg，于10 ml量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，得200 μg/ml的儲備液，密封，于4℃冰箱保存。

2.1.2 供試品溶液的制備［7，8］將制備好的雷公藤多苷微乳5 g加15 ml甲醇破乳，超聲30 min，將破乳的雷公藤多苷微乳加到已處理好含水分3%的中性氧化鋁柱(100～200目，12 g，內(nèi)徑3 cm，濕法裝柱，用適量三氯甲烷預(yù)洗)上，用乙酸乙酯-丙酮(3∶1)50 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 空白溶液的制備 將不含雷公藤多苷樣品的空白微乳制劑5 g加15 ml甲醇破乳，超聲30 min，將破乳的空白微乳按上述按2.1.2項下方法處理，得空白體系溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性［8］色譜柱:Diamond C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(90∶10);流速:1.0 ml/min;檢測波長:210 nm;進樣量:20 μl;柱溫:室溫;靈敏度:0.01 AUFS。

上述溶液分別進樣20 μl，將所得色譜圖進行比較。從圖1可見，輔料對雷公藤多苷的測定無干擾，表明本方法專屬性好。

圖1 雷公藤微乳色譜圖

2.3 標準曲線的繪制 分別精密量取儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 ml置于 10 ml容量瓶中，用甲醇定容，制備濃度分別為 2.0、4.0、10.0、20.0、30.0 μg/ml的標準溶液。按上述色譜條件依次進樣。以測得峰面積A與其濃度C線性回歸，得標準曲線方程 A=9 498.4C －1 688.2，r=0.999 9，線性范圍為2.0 ～30.0 μg/ml。

2.4 日內(nèi)精密度 分別取低、中、高3組濃度的混合對照品溶液各20 μl，在上述色譜條件下，重復(fù)進樣3次，每次進樣間隔時間為4 h，記錄峰面積，計算峰面積變異系數(shù)。雷公藤內(nèi)酯甲低、中、高3個濃度(2.0、10.0、20.0 μg/ml)峰面積的 RSD 分別為 0.40%、0.17% 和0.28%，表明所建立的HPLC方法重現(xiàn)性好。

2.5 日間精密度 分別取低、中、高3組濃度的混合對照品溶液各20 μl，在上述色譜條件下，重復(fù)進樣3次，每次進樣間隔時間為24 h，記錄峰面積，計算峰面積變異系數(shù)。雷公藤內(nèi)酯甲低、中、高3個濃度(2.0、10.0、20.0 μg/ml)峰面積的 RSD 分別為1.77%、0.84%和1.74%，表明所建立的HPLC方法重現(xiàn)性好，且測定時間內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 在供試品溶液配制后的8 h內(nèi)，每隔2 h測定1次，記錄峰面積值，其RSD值為0.86%(n=5)，表明供試品在處理后8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 取雷公藤多苷微乳5份，按2.1.2項下操作，進樣，測定峰面積并計算含量，雷公藤內(nèi)酯甲的RSD為0.98%(n=5)。

2.8 回收率試驗 精密量取低、中、高3個濃度的雷公藤內(nèi)酯甲標準品溶液加入到濃度已知的樣品溶液中，進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 雷公藤微乳回收率測定結(jié)果(n=9)

2.9 樣品含量測定 取3批樣品，依樣品溶液處理方法制備成供試品溶液，按2.1.2項下測定。用標準曲線計算3批樣品中雷公藤多苷的含量，其結(jié)果見表2。3批樣品中雷公藤內(nèi)酯甲的平均含量分別為標示量的(98.92±0.92)%，均在標示量的95%～105%之間，符合含量測定要求。

表2 雷公藤多苷微乳含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

本實驗建立了測定雷公藤微乳中雷公藤內(nèi)酯甲的反相高效液相色譜方法。經(jīng)方法學(xué)研究表明，所建立的HPLC方法靈敏，專屬性強、準確，重現(xiàn)性好。

雷公藤多苷中成分復(fù)雜，雷公藤內(nèi)酯甲的含量僅為0.263%。含量測定時一般要先進行柱處理，除去部分雜質(zhì)純化樣品，減少雜質(zhì)對目標峰的影響，利于樣品的分離測定。

測定微乳藥物含量時一般需先破乳，再以適當?shù)娜軇┨崛》蛛x后測定。而本研究中雷公藤多苷微乳中的肉豆蔻酸異丙酯溶于甲醇，故根據(jù)各成分的溶解特性，采用甲醇破乳，破乳后溶液呈澄清透明，無需提取分離，可直接過柱分離后進樣測定，實驗中發(fā)現(xiàn)采用乙腈、乙醚等破乳時均不能形成澄清透明溶液。

［1］徐央麗.雷公藤的研究進展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17(12):1914.

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