王 剛 張利敏 侯志飛 相會(huì)欣 牟飛飛 李 洪

(河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥工程系，河北 石家莊 050031)

乙酰膽堿酯酶 (AChE)抑制劑通過(guò)抑制AChE的活性，恢復(fù)乙酰膽堿 (ACh)的正常水平，提高膽堿能神經(jīng)元的興奮性，從理論和臨床上均已證明是有效的治療阿爾茨海默病(AD)的藥物〔1〕，但因?yàn)槟壳岸鄶?shù)的該類(lèi)藥物選擇性低，在抑制AChE的同時(shí)，對(duì)存在于外周組織中的丁酰膽堿酯酶(BuChE)亦產(chǎn)生抑制作用，從而引起外周擬膽堿樣的不良反應(yīng)〔2〕。因此，此類(lèi)藥物的研發(fā)是當(dāng)前新藥開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)〔3〕。9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶是我校新合成的AChE抑制劑，本文旨在觀察該藥對(duì)AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶的影響，并通過(guò)探討其對(duì)AChE和BuChE活性影響分析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，雌雄各半，清潔級(jí)，體重18～22 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，試驗(yàn)期間飼養(yǎng)于專(zhuān)用飼養(yǎng)盒內(nèi)，每盒5只，自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥物、試劑與儀器 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶由我校藥物化學(xué)教研室合成，批號(hào):060803，純度為98.9%;東莨菪堿(上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)0710019);AChE，BuChE活力檢測(cè)試劑盒和考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物研究所);UV-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);小鼠Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所研制)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組和給藥方法 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后按隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶給藥組(20、10和5 mg/kg劑量組)，每組10只，雌雄各半。于給藥前將受試物溶于蒸餾水，按0.2 ml/10 g容積進(jìn)行灌胃，每天1次，連續(xù)10 d，空白對(duì)照組及模型對(duì)照組灌胃給予等體積的蒸餾水。于第7天給藥后1 h，除空白對(duì)照組外，其余各組給予氫溴酸東莨菪堿造模，在Morris水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練前15 min小鼠腹腔注射1.5 mg/kg氫溴酸東莨菪堿，給藥容積為0.2 ml/10 g，每天1次，共4次。

1.3.2 Morris水迷宮試驗(yàn)〔4〕每天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練，連續(xù)4 d，訓(xùn)練時(shí)將小鼠放入水迷宮中自由游泳2 min以適應(yīng)環(huán)境，每天訓(xùn)練2次，間隔10 min，每次分別從2個(gè)不同入水點(diǎn)將小鼠面向容器壁放入水中游泳，記錄小鼠入水后爬上平臺(tái)所用的時(shí)間(潛伏期)，若小鼠在90 s內(nèi)不能找到水下平臺(tái)，其潛伏期按90 s記錄。最后1 d正式試驗(yàn)，記錄小鼠入水后爬上平臺(tái)的潛伏期。

1.3.3 生化指標(biāo)測(cè)定 行為學(xué)測(cè)試完成后，各組小鼠摘眼球取血，并于4℃、3 500 r/min離心15 min，取上清后－20℃保存?zhèn)溆谩Ｌ幩佬∈?，在冰塊上快速分離大腦組織，以9倍體積的生理鹽水將所取腦組織制成10%組織勻漿，將勻漿于4℃，3 500 r/min離心15 min后取上清，－20℃保存?zhèn)溆?。分別按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清BuChE活性及腦組織中AChE的活性，以考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定腦組織蛋白含量，AChE的活性以每毫克蛋白表示。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組小鼠找到平臺(tái)的潛伏期逐漸縮短。與對(duì)照組相比，模型組小鼠找到平臺(tái)潛伏期顯著延長(zhǎng)(P＜0．01)，受試物20、10 mg/kg組與模型組比較明顯縮短潛伏期(P ＜0．01或 P ＜0．05)，5 mg/kg組僅有縮短趨勢(shì)，但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見(jiàn)表1。

2.2 生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組腦組織AChE活性顯著升高(P＜0．01)，與模型組相比，受試物高、中劑量組AChE活性顯著下降(P＜0．01或P＜0．05);與對(duì)照組相比，模型組血清中BuChE活性顯著升高(P＜0．05)，受試物各劑量組BuChE活性與模型組比較無(wú)顯著差異(P＞0．05)。見(jiàn)表2。

表1 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶對(duì)東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠Morris水迷宮潛伏期的影響(± s，n=10)

表1 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶對(duì)東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠Morris水迷宮潛伏期的影響(± s，n=10)

與對(duì)照組比較:1)P ＜0．05，2)P ＜0．01;與模型組比較:3)P ＜ 0．05，4)P ＜0．01;下表同

組別 劑量(mg/kg) 第1天 第2天 第3天 第4天對(duì)照組 － 60．3 ±20．7 48．2 ±15．4 20．8 ±8．9 15．0 ±9．2模型組 － 87．4 ±19．3 75．2 ±20．01) 68．1 ±12．72) 64．2 ±19．52)受試物 20 81．2 ±15．5 60．0 ±13．1 32．2 ±15．44) 28．9 ±9．84)10 81．9 ±12．2 66．5 ±19．4 48．9 ±18．03) 39．9 ±15．44)5 86．4 ±20．5 66．9 ±19．7 60．3 ±14．8 54．0 ±16．3

表2 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶對(duì)東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶小鼠血清BuChE活性及腦組織AChE活性的影響(± s，n=10)

表2 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶對(duì)東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶小鼠血清BuChE活性及腦組織AChE活性的影響(± s，n=10)

組別 劑量(mg/kg) BuChE(U/ml) AChE(U/mg)對(duì)照組 － 2．48 ±0．32 0．58 ±0．09模型組 － 2．89±0．271) 1．32±0．122)受試物 20 2．58 ±0．28 0．78 ±0．133)10 2．73 ±0．19 1．10 ±0．194)5 2．70 ±0．37 1．23 ±0．18

3 討論

學(xué)習(xí)記憶和思維是大腦的高級(jí)活動(dòng)，記憶力下降是構(gòu)成各種癡呆癥的早期和主要癥狀。中樞膽堿能系統(tǒng)是學(xué)習(xí)記憶的重要生理基礎(chǔ)，東莨菪堿作為小鼠記憶障礙的誘導(dǎo)劑，能破壞大腦皮層和海馬以及隔區(qū)等部位的膽堿能傳遞，降低體內(nèi)抗氧化酶的活性，導(dǎo)致自由基水平的升高，破壞學(xué)習(xí)和記憶等高級(jí)機(jī)能，可模擬臨床膽堿能功能低下導(dǎo)致癡呆，被廣泛用于抗癡呆藥物的評(píng)價(jià)〔5〕。本試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠連續(xù)腹腔注射東莨菪堿7 d，可以導(dǎo)致小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，而給予膽堿酯酶抑制劑9－(吡咯烷－2－酮基)乙酰氨基－1，2，3，4－四氫吖啶可以提高 AD 模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并且可以劑量依賴(lài)性提高模型小鼠腦組織中AChE的活性，該結(jié)果可以為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

BuChE又稱(chēng)血清膽堿酯酶或假性膽堿酯酶，廣泛分布于血清、造血細(xì)胞、心、肺等外周組織中，當(dāng)抑制該酶可引起外周的擬膽堿樣的不良反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，9－(吡咯烷－2－酮基)乙酰氨基－1，2，3，4－四氫吖啶在抑制腦 AChE 活性的同時(shí)，對(duì)外周丁酰膽堿酯酶無(wú)影響，這提示其對(duì)外周的膽堿能系統(tǒng)影響較小，從而可以減小或避免以往低選擇性膽堿酯酶抑制劑所帶來(lái)的外周膽堿樣不良反應(yīng)。然而，除東莨菪堿致小鼠記憶損傷模型外，9－(吡咯烷－2－酮基)乙酰氨基－1，2，3，4－四氫吖啶的作用需進(jìn)一步在其他AD動(dòng)物模型上進(jìn)行考察，并且其作用確切機(jī)制以及最終信號(hào)通路尚待進(jìn)一步探討。

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4 黃曉舞，劉睿婷，呂秋軍．廣霍香醇對(duì)東莨菪堿致記憶障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響〔J〕．中草藥，2009;40(9):1431－3．

5 Zhang J，Zhu D，Sheng R，et al．BZYX，a novel acetylcholinesterase inhibitor，significantly improved chemicals－induced learning and memory impairments on rodents and protected PC12 cells from apoptosis induced by hydrogen peroxide〔J〕．Eur J Pharmacol，2009;613(1－3):1－9．