王鳳玲 尹延同 隋小芳 (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科,黑龍江 佳木斯 154003)

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤,已成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的主要惡性腫瘤。肺癌的形成是一個多因素作用、多基因參與、多階段逐漸形成的復(fù)雜演進(jìn)過程,為了明確肺癌的形成及轉(zhuǎn)移機制,闡述其病因和發(fā)病機制,己從基因水平進(jìn)行了許多的研究,但是有關(guān)肺癌的發(fā)病機制尚不完全清楚,直接從RNA及蛋白質(zhì)水平入手進(jìn)行研究將有可能更加全面真實地揭示肺癌的發(fā)病機制。T-鈣黏蛋白(CDH13)是一種新型的鈣枯蛋白分子,近年來學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在腫瘤中CDH13基因異常表達(dá),CDH13在多種人類腫瘤中表達(dá)減少,因此,人們推斷這種基因的功能或許是作為一種抑癌基因在起作用。但是也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)該因子在肝癌及骨肉瘤等癌細(xì)胞中呈高表達(dá)。因此,其在腫瘤中的表達(dá)水平與腫瘤的關(guān)系引起人們的探討。本課題采用RT-PCR法從基因水平檢測CDH13在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá),旨在探討其在肺癌發(fā)生發(fā)展中表達(dá)差異的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 實驗組35例,組織標(biāo)本取自佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科2009年10月至2010年7月非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)切除的肺組織。所有患者術(shù)前均未接受過放療或化療,病理診斷為肺癌,按組織學(xué)類型分為鱗癌11例、腺癌20例和腺鱗癌4例。肺癌患者年齡20～75歲,中位年齡為65.5歲。對照組1正常肺組織35例,取距離腫瘤組織邊緣5 cm以上的遠(yuǎn)離癌的正常肺組織為對照。對照組2手術(shù)切除的良性病變肺組織15例,組織標(biāo)本取自佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科同期5例肺結(jié)核球、10例支氣管擴張患者手術(shù)切除的肺組織。

1.2 標(biāo)本的采集及處理 實驗組肺組織標(biāo)本為肺葉切除離體后30 min內(nèi)迅速切取的癌組織的標(biāo)本,并取距離腫瘤組織邊緣5 cm以上的遠(yuǎn)癌正常肺組織為對照,分裝,液氮速凍,-80℃低溫保存。

1.3 主要試劑 Trizol試劑、M-Mu LV一步法 RT-PCR試劑盒均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;利用Primer5.0引物設(shè)計軟件自行設(shè)計兩條引物,上游引物:5′TCACTGGAAAGGGAGTGGATC-3′, 下 游 引 物:5′-TCTTCATAAGCCCGAACTGG-3′,內(nèi)參上游引物:5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTAC-3′,內(nèi)參下游引物:5′-GTCACCTTCACCGTTCCAG-3′,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 總RNA提取 取肺組織100 mg加入1 mlTRIzol研磨,徹底勻漿后分裝至EP管,顛倒混勻,室溫靜置5 min,加氯仿1/5體積 (0.2 ml),顛倒混勻,室溫靜置 5 min后 4℃、12 000 r/min離心 15 min,轉(zhuǎn)上層水相(約400 μ l)于另一1.5 ml EP管中,加等體積異丙醇(約400 μ l),混勻室溫靜置10 min后4℃、12 000 r/min離心10 min,棄上清加冰預(yù)冷的75%乙醇(用DEPC水配)1 ml,4℃、7 500 r/min離心5 min,棄上清,空氣干燥5 ～10 min(不能完全干燥 )加入 10 μ l RNase-free ddH2O,吹打。紫外分光光度計測定其濃度和純度后,-70℃保存。

1.4.2 RT-PCR擴增 嚴(yán)格依照RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行一步法RT-PCR擴增目的基因CDH13及內(nèi)參 β-actin。按以下程序進(jìn)行擴增:cDNA合成和預(yù)變性1個循環(huán)為38℃25 min,94℃2 min;PCR擴增40個循環(huán)為94℃15 s,56℃30 s,70℃1 min;終延伸1個循環(huán)72℃10 min。擴增結(jié)束后,取10 μ l擴增產(chǎn)物與1 μ l 6×loading Buffer混合后,在1%的瓊脂糖凝膠上電泳,溴化乙啶染色,用天能GIS凝膠圖像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。利用凝膠圖像分析軟件分析得出目的基因CDH13和內(nèi)參 β-actin PCR產(chǎn)物條帶吸收光強度值,計算目的基因和 β-actin吸收光強度值的相對比值,用以表示目的基因的相對表達(dá)強度(計算公式):目的基因CDH13的相對表達(dá)水平 =目的基因CDH13吸光強度值/β-actin光強度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以x ±s表示,采用方差齊性分析、兩樣本t檢驗,數(shù)據(jù)處理均用SPSS17.0軟件完成。

2 結(jié) 果

如圖1所示,對照組1和對照組2 CDH13在基因水平的表達(dá)無顯著差異性(0.812 7±0.059 2 vs 0.816 3±0.073 2,t=0.213,P＞0.05);實驗組(1.087 0±0.086 6)與對照組1CDH13表達(dá),肺癌組織CDH13表達(dá)明顯低于正常肺組織,存在明顯差異性(t=-25.689,P＜0.05);實驗組CDH13基因表達(dá)明顯低于對照組2(t=-23.188,P＜0.05)。在肺腺癌(22/35)中CDH13表達(dá)為0.475 8±0.064 6,在肺鱗癌(13/35)中CDHA13表達(dá)為0.564 2±0.036 6,兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012,P ＜0.05)。

圖1 各組PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

3 討 論

CDH13蛋白與其他已知的鈣黏蛋白都不同,它是截短的鈣黏蛋白(因此稱truncated-cadherin),它的一個獨特的特點就是缺少跨膜區(qū)和胞漿區(qū),而是通過糖基磷脂酞肌醇錨定在細(xì)胞膜上。它的胞外區(qū)有5個約由110個氨基酸組成的重復(fù)結(jié)構(gòu)域,在結(jié)構(gòu)上與經(jīng)典的鈣黏蛋白非常相似,只是它的N-末端區(qū)ECI不包含經(jīng)典鈣黏蛋白所共有的His-Ala-Val序列。

CDH13另外一個特征就是在細(xì)胞表面同時表達(dá)它的兩種存在形式,一種分子量為105 kD,另一種分子量為130 k D,105 k D的蛋白是成熟的T一鈣黏蛋白,而130 kD的蛋白是未剪接的前體。CDH13蛋白的基因定位在人類染色體的16q24.2-3,其cDNA全長大約為3 842 bp,包括一個含714個氨基酸的開放讀碼框,其在維持正常細(xì)胞表型中起著重要的作用〔1〕,可以抑制細(xì)胞的增殖和遷移〔2〕,因此近年來被認(rèn)為是一種新的抑癌基因,當(dāng)這種抑癌基因下降時,致使機體的防御和穩(wěn)定功能改變,對腫瘤細(xì)胞抑制作用減弱,而易發(fā)生惡性腫瘤〔3〕。

肺癌在分子遺傳學(xué)方面的特征近年來正逐漸被人們所認(rèn)識〔4〕,但其發(fā)病機制較為復(fù)雜,為多因素、多基因參與的過程〔5〕,而臨床上所診斷的肺癌多已經(jīng)為發(fā)病的中晚期,因此肺癌的防治應(yīng)從分子水平入手〔6〕。在本文實驗結(jié)果中顯示出肺癌患者目的基因CDH13的表達(dá)明顯低于正常肺組織,而正常肺組織和良性病變肺組織間對比CDH13的表達(dá)無明顯差異,且肺癌患者CDH13的表達(dá)也明顯低于良性病變肺組織,提示CDH13的低表達(dá)僅出現(xiàn)于惡性腫瘤如肺癌患者中;實驗結(jié)果還顯示出肺腺癌組織中CDH13的下降較肺鱗癌更為明顯,這種差異機制可能是因為鱗癌的發(fā)生多源于各種致癌因素導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞鱗型化所致,而腺癌細(xì)胞在某些方面表現(xiàn)為Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的特點〔7〕,恰恰 CDH13具有調(diào)節(jié)人類Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表面蛋白的生物學(xué)特性,故CDH13異常下降更易引起肺腺癌的發(fā)生〔8〕。目前研究CDH13下降的原因可能與基因異常甲基化有關(guān),而隨著研究的不斷深入,也有學(xué)者認(rèn)為多數(shù)基因的甲基化是一個可逆的過程〔9〕,因此下一步的研究重點著重于CDH13基因甲基化的研究,找出導(dǎo)致CDH13下調(diào)的原因,從而控制CDH13基因的變化,為肺癌的治療開辟一條新的領(lǐng)域。

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