于 敏 孫紅霞 (北華大學附屬醫(yī)院心內科,吉林 吉林 132013)

心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF)以心肌成纖維細胞(CFb)過度增殖、膠原蛋白分泌增加為主要特征,并參與心室重塑。近年來大量資料揭示,轉化生長因子-β1(TGF-β1)參與了 MF的發(fā)生、發(fā)展,其表達增多與 MF密切相關〔1,2〕。目前研究發(fā)現(xiàn),依那普利拉(Ena)除具有降低血壓、改善心肌供血、治療心肌梗死等作用外,還具有抑制血管平滑肌細胞和CFb增生〔3〕的作用,其作用機制尚有待進一步研究。本實驗在細胞水平上觀察 Ena對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導CFb增殖、羥脯氨酸含量變化及對 TGF-β1轉錄和表達的影響,旨在探討其抗MF的作用及機制。

1 材資料與方法

1.1 材料與細胞 Ena購自江蘇常州制藥廠;胰蛋白酶:寶泰克生物試劑;AngⅡ、四氮唑鹽(MTT)均為 Sigma公司產品;IMDM培養(yǎng)基購自HyClone Utah公司;胎牛血清(FCS):杭州四季青;Heraeus型CO2培養(yǎng)箱;SUNRISE TECAN FO39300型自動酶聯(lián)檢測儀(澳大利亞);日本Olympus倒置顯微鏡;超凈工作臺。鼠TGF-β1cDNA序列取自 Gen Bank(NO:X76881),上游引物序列:CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC,下游引物序列CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC,擴增的PCR產物大小為290 bp。所有引物序列均采用序列局部相似性查詢系統(tǒng)(BLAST)軟件分析,由上海生物工程公司合成;總RNA提取試劑盒,RT-PCR試劑盒:Promega;TGF-β1,S-P免疫組化試劑盒:福州邁新。出生1～3 d的 Wistar大鼠取心室,胰酶消化,收集細胞,置于含100 ml/L FCS的IMDM培養(yǎng)液中,在50 ml/L CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)60～90 min。采用差速貼壁法分離CFb,加入含100 ml/L FCS的IMDM繼續(xù)培養(yǎng)。經倒置顯微鏡、透射電鏡、免疫組化纖維黏連蛋白染色陽性和平滑肌肌動蛋白染色陰性鑒定為所需的CFb,純度達98%,生長近融合時按1∶3傳代,實驗采用2～4代細胞。

1.2 方法

1.2.1 分組 共分為五組,對照組:含有IMDM的培養(yǎng)液;AngⅡ組:培養(yǎng)液中加入終濃度為 10-7mol/L的 AngⅡ;Ena(10-5mol/L)組:培養(yǎng)液中同時加入終濃度為10-5mol/L Ena和10-7mol/L AngⅡ;Ena(10-6mol/L)組:培養(yǎng)液中同時加入10-6mol/L Ena和 10-7mol/L AngⅡ ;Ena(10-7mol/L)組:培養(yǎng)液中同時加入10-7mol/L Ena和10-7mol/L AngⅡ。

1.2.2 MTT比色法檢測CFb的增殖活力 各組細胞接種于96孔培養(yǎng)板,每組細胞8復孔,藥物干預24、48、72 h,于培養(yǎng)結束前4 h加入5 g/L MTT 10 μ l,待形成藍紫色的結晶沉淀后加入二甲基亞砜(DMSO)150 μ l使沉淀降解,在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm波長處測定光吸收值(A值),用只加培養(yǎng)液不加細胞的空白孔調零。

1.2.3 羥脯氨酸測定 分組同MTT法,換用24孔培養(yǎng)板,藥物作用24、48、72 h。步驟按試劑盒說明進行。

1.2.4 RT-PCR法檢測Ena對TGF-β1表達的影響 總 RNA的提取:取對數(shù)生長期CFb 5×104個/ml,接種于6孔板中,37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h,換無血清培養(yǎng)基,用含1%FCS的IMDM培養(yǎng)24～48 h,每孔分別加入不同濃度的含1%FCS的 IMDM稀釋的Ena(10-7,10-6,10-5mol/L),AngⅡ處理24 h,倒掉培養(yǎng)液,用焦碳酸二乙酯(DEPC)生理鹽水洗滌細胞2次,加入Trizol裂解液,至細胞完全裂解后,加入氯仿0.2 ml,徹底混勻后離心,吸取最上層水相,加異丙醇0.5 ml,混勻后離心沉淀RNA,再加75%乙醇除鹽,離心,沉淀即為總RNA;逆轉錄反應:在沉淀有總RNA的各管中,分別加入10×cDNA 合成緩沖液、MgCl2、oligo(d T)、4 ×d NTP、RNA酶抑制劑,反轉錄酶(AMV)和去離子水,至總體積20 μ l。42℃恒溫水浴1 h。PCR反應:于0.2 ml薄壁PCR管中分別加入10×PCR合成緩沖液,4×d NTP,上游引物,下游引物,cDNA模板,Taq酶和去離子水,至總體積50 μ l?；靹蚝?在熱循環(huán)儀上進行PCR反應,條件如下:95℃孵育 5 min,然后分別 94℃1 min,50℃1 min,72℃1.5 min,共30個循環(huán),最后72℃延伸10 min,電泳和照相;取PCR擴增產物于2%瓊脂糖凝膠電泳,溴乙啶染色,紫外透射反射儀觀察擴增產物的大小及亮度并攝影。使用凝膠分析系統(tǒng)對擴增條帶進行密度分析,以平均灰度值代表相應基因的表達量,并除以 β-actin的平均灰度值(β-actin為內參照),作為各擴增產物mRNA的相對表達量。

1.2.5 流式細胞儀檢測 Ena對TGF-β1表達的影響 細胞固定同前,加入特異的一抗TGF-β150 μ l,空白對照為0.1%磷酸鹽緩沖液(PBS),4℃孵育過夜,用 PBS洗2次,離心,棄上清,以除去非特異性結合的一抗;分別加入染色液稀釋的二抗〔FITC-抗小鼠 IgG(1∶100)〕,37℃避光孵育 45 min ～1 h;300目尼龍網過濾,上機檢測。根據FITC被激發(fā)出的熒光量的多少來確定細胞中 TGF-β1蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,實驗結果以x ±s表示,多組間的數(shù)據比較用方差分析,組間比較采用 t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 倒置顯微鏡下CFb生長形態(tài)的改變 各處理組作用24 h后,在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。對照組細胞胞體較大,胞質豐富,呈梭形,細胞間連接豐富,AngⅡ組增生活躍,呈編織狀、火焰狀,胞體增大,細胞生長密集;加入 Ena后,細胞密度逐漸降低,細胞間隙逐漸增大,細胞間連接逐漸減少,細胞體積縮小,多呈梭形或圓形,透光度降低。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下CFb生長形態(tài)(×100)

2.2 MTT法檢測CFb的增殖活力 AngⅡ可顯著提高CFb對MTT的代謝率,MTT值明顯升高,與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01),可證實AngⅡ對CFb的促增殖作用。加入不同濃度的Ena后,MTT值顯著低于AngⅡ組,與之比較有顯著性差異(P＜0.01,P＜0.05),且呈劑量依賴性。見表1。

2.3 各組羥脯氨酸含量比較 AngⅡ組羥脯氨酸含量與對照組相比差異顯著(P＜0.05);用藥后,羥脯氨酸含量下降,隨Ena濃度增加,有明顯的量效關系;與 AngⅡ組相比,Ena 10-5mol/L、Ena 10-5mol/L 24 h、Ena 10-5mol/L 48 h差異相當顯著(P＜0.01),72 h差異顯著(P＜0.05)。見表2。

2.4 RT-PCR檢測 CFb的 TGF-β1mRNA轉錄水平 AngⅡ能夠從轉錄水平上增加TGF-β1表達,與對照組相比差異顯著(P＜0.05)。Ena三個劑量組均能降低 TGF-β1轉錄,與 AngⅡ相比具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。見表3。

表1 MTT法檢測CFb的增殖活力(±s,n=8)

表1 MTT法檢測CFb的增殖活力(±s,n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05,2)P＜0.01;與AngⅡ組比較:3)P＜0.05,4)P＜0.01

組別 24 h 48 h 72 h對照組 0.265 1±0.040 3 0.254 3±0.065 3 0.115 3 ±0.010 6 AngⅡ組 0.300 0 ±0.038 31)0.344 9 ±0.020 32)0.182 0 ±0.020 71)AngⅡ +Ena 10-7組0.230 8 ±0.063 63)0.329 0 ±0.03043)0.170 6 ±0.015 0 AngⅡ +Ena 10-6組0.230 3 ±0.036 63)0.287 3 ±0.025 03)0.156 8 ±0.010 2 AngⅡ +Ena 10-5組0.228 0 ±0.042 84)0.220 6 ±0.056 04)0.140 2 ±0.014 54)

2.5 FCM檢測CFb的TGF-β1蛋白表達 AngⅡ組 TGF-β1蛋白表達量明顯升高,與對照組比較差異顯著(P＜0.05);Ena三個劑量組均不同程度降低了TGF-β1蛋白表達,與AngⅡ組相比較差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。見表3。

2.6 TGF-βmRNA與 TGF-β蛋白表達量相關性分析TGF-β1mRNA表達量與 TGF-β1蛋白含量呈現(xiàn)明顯正相關性,r=0.808 9,P ＜0.01。說明TGF-β1蛋白含量隨 TGF-β1mRNA增加而增加,表明AngⅡ能夠在轉錄水平上增加 TGF-β1合成,通過TGF-β1mRNA增加進而增加 TGF-β1蛋白表達,從而促進MF的發(fā)生。見圖2。

表2 各組不同時點羥脯氨酸含量比較( ±s,μ g/mg,n=8)

表2 各組不同時點羥脯氨酸含量比較( ±s,μ g/mg,n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05;與AngⅡ組比較:2)P＜0.05,3)P＜0.01;下表同

組別 24 h 48 h 72 h對照組 1.26 ±0.36 1.74±0.34 1.65±0.65 AngⅡ組 2.27±0.54 1)2.31±0.351)2.36 ±0.201)AngⅡ +Ena 10-7/L組 1.27±0.57 2)1.40±0.372) 1.79±0.56 AngⅡ +Ena 10-6/L組 1.21±0.23 3)1.36±0.422)1.72 ±0.302)AngⅡ +Ena 10-5/L組 1.15±0.65 3)1.28±0.433)1.67 ±0.252)

表3 Ena對CFb的TGF-β1 mRNA 及蛋白水平的影響±s,n=6)

表3 Ena對CFb的TGF-β1 mRNA 及蛋白水平的影響±s,n=6)

組別 TGF-β1/β-actin TGF-β1(/10 000 個細胞)對照組 0.35±0.07 1 514±366 AngⅡ組 0.87±0.21 1) 2 025±257 1)AngⅡ +Ena 10-7組 0.63±0.16 2) 1 810±345 2)AngⅡ +Ena 10-6組 0.42±0.07 3) 1 726±284 2)AngⅡ +Ena 10-5組 0.37±0.06 3) 1 646±243 3)

圖2 TGF-β1 mRNA與蛋白表達相關性關系

3 討 論

MF是以心臟間質成纖維細胞過度增殖和膠原過度沉積及異常分布為特征的心臟間質重構。AngⅡ通過作用于CFb上的Ang受體(AT1),引起CFb增殖和膠原合成增加,導致MF發(fā)生〔4〕。本實驗結果顯示,給予Ena后,可使 AngⅡ作用下的CFb MTT-OD值顯著降低,同時膠原含量明顯下降,表明Ena可以抑制CFb增殖并可劑量依賴性地抑制AngⅡ誘導的膠原分泌。

TGF-β1是導致 MF諸多因素最后的共同中介之一,能使體外培養(yǎng)細胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達增加,并增加Ⅰ型膠原m RNA的穩(wěn)定性。近年研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1和AngⅡ之間有密切作用,在MF過程中,AngⅡ增加TGF-β1基因的表達,而 TGF-β1則抑制細胞外基質(ECM)降解、增加ECM mRNA表達和蛋白質合成〔5〕。TGF-β 在心肌中對于細胞增殖、分化、遷移和 ECM的沉積均有重要的作用。TGF-β1受體在心肌細胞和非心肌細胞均有分布〔6〕,實驗證明新生鼠心肌細胞表面存在 TGF-β1Ⅰ 型、Ⅱ型和 Ⅲ 型受體〔7〕,TGF-β1受體還存在于 CFb〔8〕。 Yao等〔9〕發(fā)現(xiàn)在CFb中,TGF-β1可激發(fā)膠原酶和膠原酶啟動子的活性。有實驗證明AngⅡ通過 TGF-β1誘導ECM的合成〔10〕。

Ena是依那普利的活性形式,可抑制CFb的增殖和膠原合成,但Ena干預下的CFb的TGF-β1mRNA和蛋白表達量的變化及其與MF的關系報導不多。本實驗結果表明:AngⅡ組TGF-β1mRNA及其蛋白表達量明顯升高,用藥后Ena各劑量組TGF-β1mRNA和蛋白表達量均不同程度降低,與 AngⅡ組相比差異顯著,對TGF-β1轉錄水平和蛋白表達的相關性分析表明,二者呈顯著正相關,表明TGF-β1表達水平的升高是由于其轉錄活性增強所致,Ena通過抑制CFb的TGF-β1轉錄水平從而抑制TGF-β1蛋白表達。

由上可知,TGF-β1通過抑制ECM 降解,促進膠原合成,誘導MF的發(fā)生;而 Ena通過抑制TGF-β1的轉錄和蛋白表達,劑量依賴性地降低膠原蛋白的合成和分泌,拮抗AngⅡ的部分生物活性,抑制CFb增殖及膠原合成,從而抑制MF的發(fā)生。

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