王柏欣 阮 洋 賈秀月 陳 梅 王 昕 邱洪斌 王淑秋 (佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 54007)

辛伐他汀是一種羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶抑制劑,能減少膽固醇的生物合成,是一種臨床上廣泛使用的降血脂藥物。最近實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能減輕腦缺血再灌注損傷,但其機(jī)制尚未完全闡明。本課題擬觀察腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF),GAP-43,巢蛋白(Nestin)的表達(dá),旨在探討辛伐他汀對(duì)腦缺血再灌注的保護(hù)作用及機(jī)制,并為探索神經(jīng)損傷修復(fù)機(jī)制及篩選新藥、建立新的腦損傷治療方法奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康成年Wistar大鼠,250～300 g,隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組,辛伐他汀組。模型組和辛伐他汀組都應(yīng)用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型,缺血時(shí)間為30 min,再灌注時(shí)間分別為 1、2、3、5、7 d,每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 6 只大鼠。辛伐他汀組在術(shù)后第1天開(kāi)始,予辛伐他汀20 mg/kg灌胃;假手術(shù)組及缺血再灌注模型組用相同體積的等滲鹽水灌胃,正常組正常喂養(yǎng)。

1.2 試劑 辛伐他汀由浙江京新藥業(yè)股份有限公司提供;FITC標(biāo)記二抗,NGF、GAP-43、Nestin一抗由上海滬峰生物試劑公司提供;辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗,β-actin,由北京中杉提供;預(yù)染蛋白Marker由 Fermentas公司提供;PVDF膜由美國(guó)Millipore公司提供;ECL發(fā)光試劑盒,BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 建立腦缺血再灌注模型 根據(jù)大腦中動(dòng)脈栓塞法制備腦缺血再灌注模型。稱重,10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉;將動(dòng)物仰臥位固定(上門(mén)齒、四肢遠(yuǎn)端用粗線固定于鼠板上),碘伏消毒頸部皮膚,頸部正中切口,分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈以及頸內(nèi)動(dòng)脈,分別接扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈,在頸總動(dòng)脈距離分叉處將尼龍線導(dǎo)入頸內(nèi)動(dòng)脈,插入線栓深度約為(18.0±0.5)mm,感到輕微阻力時(shí)立即停止插線。此后縫合傷口,留置線頭于體外,30 min后將線拴提至頸總動(dòng)脈內(nèi),完成再灌注。術(shù)后將室溫控制在25℃ ～30℃,視動(dòng)物狀況注射呋塞咪(速尿)或抗生素預(yù)防腦水腫和感染。假手術(shù)組除進(jìn)線1.5 mm外,其余相同。辛伐他汀組在模型制作成功后,在術(shù)后第1天開(kāi)始給藥。

1.3.2 大鼠神經(jīng)功能Zea-longa評(píng)分 (1)無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀、活動(dòng)正常者,計(jì)0分;(2)不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪,計(jì)1分;(3)動(dòng)物爬行時(shí)出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象),計(jì)2分;(4)身體向偏癱側(cè)傾倒者,計(jì)3分;(5)不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失者,計(jì)4分。評(píng)分為0分和4分者均被剔除,神經(jīng)功能評(píng)價(jià)在取材前進(jìn)行。

1.3.3 組織切片的制備以及免疫熒光檢測(cè) 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束點(diǎn)將各組動(dòng)物麻醉,經(jīng)左心室插管,然后快速灌注生理鹽水約250 ml進(jìn)行心臟灌洗,雙肺變白后用4%多聚甲醛灌洗固定直到身體僵硬,迅速斷頭取腦,于視交叉后冠狀切取4 mm厚度組織塊,4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片。分別行HE染色,神經(jīng)細(xì)胞TUNEL染色法,免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)。

1.3.4 腦組織蛋白的提取以及Western印跡檢測(cè) 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束點(diǎn)將各組動(dòng)物斷頭取腦,于冰上分離缺血側(cè)頂葉皮層腦組織,用冰生理鹽水沖洗后,將腦組織置于組織勻漿器中,按照1:10(wt/vol)加入細(xì)胞裂解液,置于冰上進(jìn)行勻漿,多重復(fù)碾幾次使腦組織盡量碾碎。完全碾碎后,用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中,然后以12 000 r/min 4℃離心10 min,取上清液置于 -80℃保存。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF濾膜,然后用5%脫脂牛奶封閉,特異性一抗,NGF(1∶100),GAP-43(1∶100)、Nestin(1∶100),37℃過(guò)夜,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗 (1∶10 000)孵育2 h后,與ECL發(fā)光反應(yīng)后顯影。用Image pro plus圖像處理系統(tǒng)分析熒光圖片的平均熒光強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 激光共聚焦結(jié)果分析 正常組、假手術(shù)組大鼠熒光強(qiáng)度都很弱,兩組之間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。模型組與辛伐他汀組各亞組在缺血再灌注后1 d開(kāi)始升高,在7 d達(dá)到高峰;辛伐他汀組與模型組在相同時(shí)間點(diǎn)比較,NGF、Nestin、GAP-43的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1 ～表3,圖1～圖3。

表1 GAP-43的熒光強(qiáng)度的表達(dá) ±s,n=6,平均熒光強(qiáng)度)

表1 GAP-43的熒光強(qiáng)度的表達(dá) ±s,n=6,平均熒光強(qiáng)度)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 1 d 2 d 3 d 5 d 7 d正常組 0.002 713 ±0.000 12 0.002 713 ±0.000 12 0.002 713 ±0.000 12 0.002 713 ±0.000 12 0.0027 14 ±0.000 12假手術(shù)組 0.003 154 ±0.000 167 0.003 154 ±0.000 167 0.003 154 ±0.000 167 0.003 154 ±0.000 167 0.003 154 ±0.000 167模型組 0.011 813 ±0.000 792 1) 0.020 565 ±0.001 0571) 0.039 812 ±0.008 8411) 0.060 73 ±0.009 7371) 0.082 41 ±0.0147 63 1)辛伐他汀組 0.021 367 ±0.006 3841)2) 0.040 097 ±0.007 7681) 0.063 60 ±0.008 9351)2) 0.081 71 ±0.003 441)2) 0.147 081 ±0.003 521)2)

表2 NGF熒光強(qiáng)度的表達(dá)(±s,n=6,平均熒光強(qiáng)度)

表2 NGF熒光強(qiáng)度的表達(dá)(±s,n=6,平均熒光強(qiáng)度)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 1 d 2 d 3 d 5 d 7 d正常組 0.003 065 ±0.000 14 0.003 066 ±0.000 14 0.003 065 ±0.000 14 0.003 066 ±0.000 14 0.0030 65 ±0.000 14假手術(shù)組 0.002 835 ±0.000 321 0.002 835 ±0.000 321 0.002 835 ±0.000 321 0.002 835 ±0.000 321 0.002 835 ±0.000 321模型組 0.010 227 ±0.001 121 1) 0.022 078±0.006 5671) 0.041 891 ±0.001 158 41) 0.074 107 ±0.034 0571) 0.100 335 ±0.019 4031)辛伐他汀組 0.018 746 ±0.002 7041)2) 0.040 554 ±0.003 7471)2) 0.060 146 ±0.001 060 41)2) 0.109 431 ±0.029 8381)2) 0.145 845 ±0.029 1661)2)

表3 Nestin的熒光強(qiáng)度表達(dá)±s,n=6,平均熒光強(qiáng)度)

表3 Nestin的熒光強(qiáng)度表達(dá)±s,n=6,平均熒光強(qiáng)度)

與同時(shí)間段假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與同時(shí)間段模型組比較:2)P＜0.05

組別 1 d 2 d 3 d 5 d 7 d正常組 0.003 888 ±0.000 998 0.003 114 ±0.000 374 3 0.003 114 ±0.000 374 0.003 114 ±0.000 374 0.003 114 ±0.000 374假手術(shù)組 0.003 822 3 ±0.000 986 0.003 823 ±0.000 986 0.003 563 ±0.000 857 0.003 546 ±0.000 857 0.002 999 ±0.001 548模型組 0.010 79±0.001 5211) 0.024 863 ±0.002 81) 0.041 324 ±0.001 4471) 0.063 386±0.001 641) 0.089 475 ±0.010 0011)辛伐他汀組 0.020 268±0.0008281)2) 0.042 096±0.002 061)2) 0.069 788 ±0.000 9241)2) 0.094 081 ±0.001 9771)2) 0.133 867 ±0.011 9321)2)

2.2 Western印跡結(jié)果比較 正常組、假手術(shù)組大鼠腦組織表達(dá)量都很弱,兩組之間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。模型組與辛伐他汀組在缺血再灌注后1 d開(kāi)始升高,在7 d達(dá)到高峰;辛伐他汀組與模型組在相同時(shí)間點(diǎn)比較,NGF、Nestin、GAP-43的表達(dá)量明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖4～圖6。

圖1 GAP-43激光共聚焦結(jié)果

圖2 NGF激光共聚焦結(jié)果

圖3 Nestin共聚焦結(jié)果

圖4 各組GAP-43表達(dá)

圖5 各組NGF表達(dá)

圖6 各組Nestin表達(dá)

3 討 論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),腦缺血損傷可誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖〔1〕,巢蛋白(Nestin)是神經(jīng)干細(xì)胞特異表達(dá)的中間絲蛋白中的第Ⅵ類中間絲蛋白,作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物,Nestin是一種獨(dú)特的神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗原,在神經(jīng)胚胎發(fā)育過(guò)程中不斷增殖的神經(jīng)上皮干細(xì)胞中短暫地表達(dá),在正常成年動(dòng)物腦中僅在室管膜下層、內(nèi)皮細(xì)胞和脈絡(luò)膜中有表達(dá)。研究表明,在腦損傷及腦缺血時(shí)Nestin在膠質(zhì)細(xì)胞中迅速表達(dá),是中樞神經(jīng)系統(tǒng)早期損傷的標(biāo)志物〔2〕。還有研究表明,Nestin被中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)大多數(shù)增殖活躍的前體細(xì)胞所表達(dá),發(fā)育成熟的神經(jīng)系統(tǒng)Nestin表達(dá)降低,而損傷的神經(jīng)系統(tǒng)Nestin表達(dá)又重新增高〔3〕。因此,探討腦缺血損傷后Nestin的表達(dá)情況,有助于了解腦缺血后的神經(jīng)修復(fù)機(jī)制

GAP-43是神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白,分布于神經(jīng)元、再生的施萬(wàn)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,被認(rèn)為是神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)發(fā)育和可塑性的分子標(biāo)記物〔4,5〕。神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、軸突再生和突觸重構(gòu)。神經(jīng)損傷與再生時(shí),軸突內(nèi)GAP-43的含量可增加20～100倍〔6,7〕,為神經(jīng)元軸突的修復(fù)和再生提供了足夠的營(yíng)養(yǎng)供給。

NGF是一組由多種細(xì)胞分泌的對(duì)神經(jīng)組織起特殊營(yíng)養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)或多肽分子,是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員之一。研究表明,NGF不僅具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用,而且能促進(jìn)受損神經(jīng)元的再生,改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)〔8〕,亦對(duì)缺血、缺氧后神經(jīng)損傷具有重要的保護(hù)和修復(fù)作用〔9〕。

有報(bào)道認(rèn)為他汀類藥可能通過(guò)多種途徑、多種機(jī)制保護(hù)缺血腦組織、挽救缺血半暗帶〔10〕。本研究結(jié)果顯示,缺血再灌注損傷后,NGF、GAP-43、Nestin表達(dá)均增加,說(shuō)明損傷可誘導(dǎo)NGF、GAP-43、Nestin的合成;辛伐他汀可顯著上調(diào)大鼠缺血腦組織中NGF、GAP-43、Nestin的表達(dá),表明辛伐他汀可以通過(guò)上調(diào)NGF、GAP-43、Nestin的表達(dá),減輕缺血損傷,從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

1 Korzhevskii DE,Lentsman MV,Gilyarov AV,et al.Induction of nestin synthesis in rat brain cells by ischemic damage〔J〕.Neuro Sci Behav Physiol,2008;38(2):139-40.

2 Yagita Y,Kitagava K,Sasaki T,et al.Differential expression of Musashil and nestin in the adult rat hippocampus after ischemia〔J〕.J Neurosic Res,2002;69(6):750-6.

3 Pekny M,Johansson CB,Eliasson C,et al.Abnormal reaction to central nervous system injury in mice lacking glial fibrillay acidic protein and vimentin〔J〕.Cell Biol,1999;145(3):503-14.

4 Wang XY,Zhang JT.Effects of ginsenoside Rglonsynaptic plasticity of freely moving and its mechanism of action 〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2001;22(7):1157-62.

5 Hassiotis M,Ashwell KW,Marotte LR,et al.GA P-43 Immunoreactivity in the brain of the developing and adult walla〔J〕.Anat Embr,2002;206(1-2):97-118.

6 Tolner EA,van Vliet EA,Holtmaat AJ,et al.GAP-43 mRNA and protein expression in the hippocampal and parahippocampal region during the course of epileptogenesis in rats 〔J〕.Eur J Neurosci,2003;17(11):2369-80.

7 Carrasco J,Penkowa M,Giralt M,et al.Role of metallothionein-III following central nervous system damage〔J〕.Neurobiol Dis,2003;13(1):22-36.

8 Snider WD,Johnson EM.Neurotrophic molecules〔J〕.Ann Neurol,1989;26:489-93.

9 Korsching S.The role of nerve growth factor in the CNS〔J〕.TiNS,1986;7:487.

10 謝 坤,李 勇.他汀類藥物的多效性研究〔J〕.世界臨床藥物,2005;26(10):589-91.