杜慶聰 裴艷濤 楊國濤 孫雪飛 尹秋偉 吳銘生 (山東大學齊魯醫(yī)院胸外科,山東 濟南 25002)

藤梨根為獼猴桃科獼猴桃屬軟棗獼猴桃的根,味甘、咸寒、微澀,具有清熱解毒、消腫疥、祛風濕的功效。臨床上常用于抗腫瘤治療,尤其對消化道腫瘤療效較佳。近年研究發(fā)現(xiàn),藤梨根提取物體外對多種腫瘤有抑制作用。不同方法萃取的提取物對腫瘤的抑制效果不同,有研究顯示藤梨根乙酸乙酯提取物抗腫瘤效果較佳〔1〕。有關藤梨根對肺癌的作用尚未見報道。本研究以肺腺癌A549細胞系作為研究對象,觀察藤梨根乙酸乙酯提取物對肺腺癌A549細胞的生長抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系與細胞培養(yǎng) 肺癌A549細胞系由山東省醫(yī)學科學院基礎所惠贈。培養(yǎng)在含10%小牛血清,青霉素及鏈霉素各100 U/ml的 RPMI 1640培養(yǎng)液中,37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.1.2 藤梨根乙酸乙酯提取物的制備 將藤梨根(購自濟南建聯(lián)藥店)500 g粉碎成20目的粗粉→加8倍水煮2次,每次1 h;過濾濃縮→加入乙酸乙酯溶媒萃取3次(每次300 ml)→回收溶媒,得濃縮物約25 g(含三萜類物質)→蒸餾水熱溶→過濾→濾液供實驗用(無菌)。

1.1.3 主要儀器和試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司),小牛血清(美國 Hyclone公司),四唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶均購自美國 Sigma公司。全自動CO2孵箱(美國杜邦公司 Napoc6100),倒置顯微鏡(日產Olympus,ZMT-413),450型酶標儀(美國BioRad生產)。鼠抗人Ki-67單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒、正常山羊血清購自北京中山生物技術有限公司;標記脫氧嘧啶核苷酸(3H-TdR)(北京原子能研究所);LKB-1217液體閃爍計數器(瑞典產品)。

1.2 方法

1.2.1 藥物濃度及配制方法 按照藥物血漿峰值濃度(PPC)和預實驗結果,以DMSO作為溶劑,將藤梨根乙酸乙酯提取物在臨用前用RPMI 1640培養(yǎng)液分別配制成不同的濃度,實驗中藤梨根乙酸乙酯提取物的工作終濃度分別為10、20、40、80、160、320 μ g/ml,并使 其 中 DMSO 的 終濃 度 均 不 超 過0.04%。并設空白對照組(0.04%DMSO+細胞)。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察藤梨根乙酸乙酯提取物作用后A549細胞形態(tài)學變化 取對數生長期的A549細胞,用RPMI 1640培養(yǎng)液制細胞懸液,計數,調整成細胞濃度為1.0×105個/ml的細胞懸液,分別接種于25 ml培養(yǎng)瓶中,每瓶3 ml。37℃常規(guī)培養(yǎng)24 h,細胞貼壁后分組:對照組加入含0.04%DMSO的培養(yǎng)液。實驗組分別加入新配制的含不同濃度藤梨根乙酸乙酯提取物的培養(yǎng)液,倒置顯微鏡下動態(tài)觀察A549細胞用藥后24、48、72 h的細胞體積及細胞膜、細胞核等形態(tài)變化。

1.2.3 MTT檢測藤梨根乙酸乙酯提取物對A549細胞增殖活性的影響 取對數生長期的A549細胞,經0.25%胰蛋白酶消化后,吹打成單細胞懸液,調整細胞濃度為5.0×104個/ml,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μ l,含細胞5×103,培養(yǎng)24 h待細胞貼壁生長良好時,棄原培養(yǎng)液。實驗組分別加入新配制的含不同濃度藤梨根乙酸乙酯提取物的培養(yǎng)液,每個濃度24復孔,6個復孔為一組。對照孔加入含0.04%DMSO的培養(yǎng)液,另設不加細胞孔為空白對照,37℃、5%CO2飽和濕度下分別培養(yǎng)24、48、72、96 h,棄上清,每孔中加入 MTT 溶液 (5 g/L)20 μ l,37℃繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內上清液,每孔加入150 μ l DMSO振蕩10 min后比色,選擇490 nm波長,在酶標儀上測定各孔光吸收值(OD),以空白對照孔調零,記錄結果。按Bliss法計算半數抑制濃度(IC50值)。

1.2.4 集落形成實驗觀察藤梨根乙酸乙酯提取物對肺癌克隆原細胞增殖的影響 取對數生長期的A549細胞,經0.25%胰蛋白酶消化后,調整細胞濃度為500個/ml,接種于35 mm培養(yǎng)皿中,每皿2 ml,實驗組加入新配制的含不同濃度藤梨根乙酸乙酯提取物的培養(yǎng)液,對照組用含0.04%DMSO的培養(yǎng)液,每組4個培養(yǎng)皿,搖勻后置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)7 d,棄去培養(yǎng)液,甲醛固定,Giemsa染色,鏡下計數每皿大于50個細胞以上的集落數目。計算集落形成率、集落形成抑制率。集落形成率(%)=(每皿集落數/每皿接種細胞數)×100%。集落形成抑制率(%)=(1-實驗組集落數/對照組集落數)×100%。

1.2.53H-摻入法檢測藤梨根乙酸乙酯提取物對A549細胞DNA合成的影響 取對數生長期的A549細胞,經0.25%胰蛋白酶消化后,吹打成單細胞懸液,調整細胞濃度為4.0×104個/ml。接種于96孔培養(yǎng)板內,每孔200 μ l。實驗孔加入終濃度分別為20、40、80、160 μ g/ml的含藤梨根乙酸乙酯提取物的培養(yǎng)液,每組設6個平行孔,設對照孔(0.04%DMSO+細胞),分別處理 24、48、72 h。終止培養(yǎng)前 6 h,每孔加入3H-TdR 37 kBq(37 k Bq/ml);培養(yǎng)終止后,經清洗、消化、離心等步驟,用液體閃爍計數器測定每分鐘脈沖數(cpm)值;按下式計算不同濃度藤梨根乙酸乙酯提取物作用不同時間對A549細胞DNA合成的抑制率:摻入抑制率(%)=(1-實驗孔平均cpm值/對照組平均cpm值)×100%。

1.2.6 免疫組織化學(SP)法檢測藤梨根乙酸乙酯提取物對A549細胞Ki-67抗原蛋白表達的影響 將經多聚賴氨酸處理的小載玻片預先置于12孔培養(yǎng)板中,取對數生長期的A549細胞,0.25%胰蛋白酶消化后,調整細胞濃度為1.0×105個/ml,然后接種細胞于培養(yǎng)板。待細胞貼壁生長良好時,棄原培養(yǎng)液,分別加入終濃度為 20 、40 、80 、160 μ g/ml的含藤 梨根乙酸乙酯提取物的培養(yǎng)液3 ml,每濃度設6個復孔,并設對照孔(0.04%DMSO+細胞)。置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h,倒去孔內培養(yǎng)液,取出載玻片,晾干;用4%多聚甲醛固定10 min(4℃)。采用鏈霉素-生物素(SP)免疫組化技術檢測Ki-67抗原表達,全部操作過程嚴格按照SP試劑盒說明書完成。組織抗原修復采用微波抗原修復法;Ki-67抗原單抗工作濃度均為1∶100。采用已知陽性對照片作陽性對照;以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。Ki-67抗原陽性結果判定為細胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒。將其置于Olympus顯微鏡下400倍高倍視野下觀察,對所測部位進行準確定位后,由攝像系統(tǒng)提取數值化細胞圖像輸入捷達801系列形態(tài)學分析系統(tǒng),每例選取4個視野進行陽性率測定。以Ki-67抗原陽性表達率為增殖指數(proliferation index,PI)。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析,數據資料以±s表示,組間差異比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 藤梨根乙酸乙酯提取物對人肺癌A549細胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡下見用藥前細胞排布緊密,貼壁生長,細胞為多邊形,核分裂象多見,有細胞重疊,細胞圓亮、飽滿,細胞間連接緊密。經過10、20 μ g/ml濃度藤梨根乙酸乙酯提取物處理后細胞數目減少,但形態(tài)學改變不明顯。當藤梨根乙酸乙酯提取物濃度達到40 μ g/ml時,出現(xiàn)一定程度的形態(tài)改變,表現(xiàn)為細胞間連接減少、胞突回縮,細胞體積變小,變圓形;核分裂象減少,核固縮出現(xiàn),核顏色加深;重疊生長現(xiàn)象減少,細胞數目減少;胞質透亮度下降,顆粒感增強,折光性增強;細胞脫落呈懸浮狀,并見細胞碎片。上述變化隨藤梨根乙酸乙酯提取物作用時間的延長和濃度的增加而明顯。尤其經過濃度為160、320 μ g/ml的藤梨根乙酸乙酯提取物處理后細胞形態(tài)學改變明顯,細胞形態(tài)極度不規(guī)則,細胞崩解形成碎片,見較多死亡細胞。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下藤梨根乙酸乙酯提取物對A549細胞形態(tài)變化的影響(×100)

2.2 藤梨根乙酸乙酯提取物對肺癌A549細胞增殖活性的影響 結果顯示一定濃度的藤梨根乙酸乙酯提取物對人肺癌A549細胞的生長有明顯的抑制作用,且呈劑量依賴性。當藤梨根乙酸乙酯提取物濃度為 10 μ g/ml時抑制不明顯;濃度在20 μ g/ml時即表現(xiàn)一定的抑制;此后隨著藤梨根乙酸乙酯提取物濃度的增加,實驗孔內吸光值逐漸降低,濃度在160 μ g/ml時對 A549細胞的生長抑制效果最佳,而濃度在320 μ g/ml時抑制作用無明顯增加;并且在同一濃度,隨著作用時間的延長,抑制作用逐漸增大,呈現(xiàn)出明顯的時間和劑量依賴性。濃度 ＞40 μ g/ml時,藤梨根乙酸乙酯提取物作用各時段吸光值與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);濃度為20 μ g/ml時,作用72 h、96 h后的吸光值與對照組比較才有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。藤梨根乙酸乙酯提取物作用48 h、72 h、96 h的IC50分別為 129.36 μ g/ml、75.42 μ g/ml、58.88 μ g/ml。 見表 1 。

表1 不同濃度藤梨根乙酸乙酯提取物作用后各組細胞吸光值變化(±s,n=6)

表1 不同濃度藤梨根乙酸乙酯提取物作用后各組細胞吸光值變化(±s,n=6)

與對照組比較:1)P＜0.05;下表同

組別 劑量(μ g/ml) 24 h 48 h 72 h 96 h對照組 - 0.344 ±0.089 0.521 ±0.068 0.872 ±0.074 1.337 ±0.059實驗組 10 0.339 ±0.065 0.509 ±0.080 0.851 ±0.079 1.300 ±0.082 20 0.326 ±0.013 0.465 ±0.019 0.694 ±0.0231)0.997 ±0.0211)40 0.267 ±0.0351)0.368 ±0.0461)0.557 ±0.0511)0.742 ±0.0441)80 0.237 ±0.0431)0.308 ±0.0271)0.417 ±0.0421)0.527 ±0.0361)160 0.192 ±0.0521)0.216 ±0.0481)0.258 ±0.0391)0.273 ±0.0351)320 0.189 ±0.0481)0.209 ±0.0371)0.241 ±0.0311)0.266 ±0.0431)

2.3 藤梨根乙酸乙酯提取物對肺癌克隆原細胞增殖的影響集落形成實驗結果顯示,當藤梨根乙酸乙酯提取物濃度為10 μ g/ml時,對A549細胞的集落形成無明顯的抑制作用;當藤梨根乙酸乙酯提取物濃度 ＞20 μ g/ml時對A549細胞集落形成均有抑制作用,并且隨著藤梨根乙酸乙酯提取物濃度的增高,抑制作用逐漸明顯,集落形成率逐漸降低,集落抑制率逐漸增高,但 160 μ g/ml和320 μ g/ml兩種濃度的抑制作用相似,無明顯差別;濃度 ＞20 μ g/ml時,各組集落形成數與對照組比較差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

2.4 藤梨根乙酸乙酯提取物對肺癌A549細胞DNA合成的影響 結果顯示藤梨根乙酸乙酯提取物對人肺癌A549細胞的DNA合成有明顯的抑制作用,且隨著藤梨根乙酸乙酯提取物濃度的增加和作用時間的延長,抑制作用逐漸增強。給藥24 h后,80、160 μ g/ml組cpm值下降,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);給藥48 h后40 μ g/ml組cpm值與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而20 μ g/ml組則與對照組比較cpm值始終無顯著差異。見表3。

表2 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后肺癌A549細胞的集落形成情況(±s,n=4)

表2 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后肺癌A549細胞的集落形成情況(±s,n=4)

組別 劑量(μ g/ml) 集落形成數 集落形成率(%)集落形成抑制率(%)對照組 - 613.24±23.67 61.32 -實驗組 10 597.68±27.18 59.77 2.54 20 482.31±22.62 1) 48.23 21.35 40 346.73±23.45 1) 34.67 43.46 80 246.61±15.89 1) 24.66 56.85 160 141.54±14.24 1) 14.15 76.92 320 140.19±10.32 1) 14.02 77.14

表3 不同濃度藤梨根提取物對肺癌A549細胞3 H-摻入率的影響(±s,n=6)

表3 不同濃度藤梨根提取物對肺癌A549細胞3 H-摻入率的影響(±s,n=6)

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2.5 藤梨根乙酸乙酯提取物對肺癌A549細胞Ki-67抗原表達的影響 Ki-67抗原陽性表現(xiàn)為細胞核顯示棕黃色顆粒。藤梨根乙酸乙酯提取物對A549細胞的Ki-67抗原表達有明顯的抑制作用,隨著藤梨根乙酸乙酯提取物濃度的增加和作用時間的延長,細胞 PI逐漸降低,仍以 40、80 、160 μ g/ml 組作用明顯,與對照組比較差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表4,圖2。

圖2 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后A549細胞Ki-67抗原表達(SP,×200)

表4 藤梨根乙酸乙酯提取物對肺癌細胞Ki-67抗原表達的影響(±s,%,n=6)

表4 藤梨根乙酸乙酯提取物對肺癌細胞Ki-67抗原表達的影響(±s,%,n=6)

組別 劑量(μ g/ml) 24 h 48 h對照組 - 78.14±3.42 82.45±4.23實驗組 20 72.25±6.45 67.95±5.83 40 65.34±5.78 1) 56.38 ±4.821)80 54.63±6.12 1) 38.66 ±3.451)160 40.54±4.39 1) 26.40 ±5.271)

3 討 論

目前肺癌的治療除手術之外,仍以化療、放療為主。這些治療的副作用較大,在殺滅腫瘤細胞的同時常對正常組織產生損傷,如骨髓抑制、肝腎損害等 。中藥抗腫瘤已有悠久的歷史,中藥的低毒、安全、有效已是人們普遍接受的事實,從中藥及其他天然藥物中尋找新的抗腫瘤藥物已成為目前研究的熱點。藤梨根(Radix Actinidiae)為獼猴桃科獼猴桃屬軟棗獼猴桃的根,近年實驗研究也表明復方藤梨根制劑對高轉移性人肺腺癌細胞(PG)有較強的殺傷作用,抑制其生長,呈量效關系,抑制率最高達63.67%,可使細胞阻滯于 G0/G1期和細胞內〔Ca2+〕升高,并且上調細胞間隙連接通訊(GJIC)功能;增強多藥耐藥(MDR)細胞株內阿霉素(ADR)的積聚,減少ADR的外排,部分逆轉耐藥株K562/ADR和K562/長春新堿(VCR)細胞的MDR;在轉錄水平下調MDR1 mRNA的表達,從而降低MDR細胞內P-糖蛋白(P-gp)的表達〔2～6〕。因此其抗腫瘤藥理研究和臨床驗證受到廣泛關注。本文自制藤梨根乙酸乙酯提取物,觀察其對肺癌細胞生長增殖的影響,并探討其可能的作用機制。

本研究結果顯示藤梨根乙酸乙酯提取物對體外培養(yǎng)的A549細胞有明顯的生長抑制和殺傷作用,此作用與藤梨根乙酸乙酯提取物濃度和作用時間有關。當濃度≤20 μ g/ml時,作用不明顯;當濃度 ≥40 μ g/ml時,抑制作 用增強;當濃度 ≥160 μ g/ml時,效果趨于平緩。隨著作用時間的延長,抑制作用逐漸增加,呈現(xiàn)出明顯的時間依賴性。證實藤梨根乙酸乙酯提取物具有抗肺癌的作用。

克隆原細胞是指具有持續(xù)分裂和自我更新能力的細胞,腫瘤的生長、轉移、復發(fā)均以克隆原細胞的增殖為基礎。集落形成實驗反映腫瘤細胞中具有增殖活性的克隆原細胞的增殖能力和潛力,本實驗結果顯示當藤梨根乙酸乙酯提取物濃度 ＞20 μ g/ml時對肺癌克隆原細胞具有較強的抑制作用,可抑制A549細胞的集落形成率,并存在劑量-效應關系。表明藤梨根乙酸乙酯提取物可以抑制肺癌克隆原細胞的生長,也證實其具有抗肺癌活性。

以上實驗顯示當劑量 ＜20 μ g/ml時抑制作用不明顯,而 ＞160 μ g/ml時抑制作用無明顯增強。故進一步實驗采用20、40、80、160 μ g/ml等四個濃度進行,并通過3H-Td R 摻入試驗檢測細胞DNA合成、免疫組化SP法檢測Ki-67抗原表達的方法,對藤梨根乙酸乙酯提取物抗肺癌作用機制進行初步探討。結果顯示隨著藤梨根乙酸乙酯提取物濃度的增加和作用時間的延長,A549細胞的cpm值及PI逐漸降低。表明藤梨根乙酸乙酯提取物對A549細胞的DNA合成有明顯的抑制作用,可下調A549細胞Ki-67抗原表達強度,從而降低細胞增殖活性,使細胞增殖受到抑制,此為藤梨根乙酸乙酯提取物抑制肺癌細胞增殖的機制及靶點。而藤梨根乙酸乙酯提取物中的三萜類化合物,可能是其抗肺癌作用的物質基礎〔7〕。

總之,應用現(xiàn)代藥理、藥學的理論及方法深入研究藤梨根有效成分的藥用價值和作用機制,對藤梨根的開發(fā)應用具有極為重要的經濟和社會意義。本研究說明藤梨根乙酸乙酯提取物在體外對肺癌細胞有較強的抑制作用,且呈現(xiàn)出時間與劑量依賴性,抗肺癌作用與抑制肺癌細胞DNA合成、下調Ki-67抗原表達強度、降低癌細胞增殖活性有關,表明藤梨根乙酸乙酯提取物在治療肺癌方面將具有良好的臨床應用和開發(fā)前景,但其具體抗肺癌機制有待進一步研究。

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