張 梅， 李 衛(wèi)， 郭瑞鮮， 羅健東， 馮鑒強(qiáng)△

(1 廣州醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 廣州510082;2 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州510632;3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理教研室，廣東 廣州510080)

適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)是指某些“亞傷害性”應(yīng)激預(yù)處理可以減輕后續(xù)更嚴(yán)重的損害。作為機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的天然機(jī)制，適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)是在不改變攻擊因子性質(zhì)的情況下，通過(guò)外源性的適宜刺激(預(yù)處理)調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的防護(hù)機(jī)制，加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)損傷的抵抗能力。適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)作用的存在為主動(dòng)防治某些疾病提供了可能。本課題組利用腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞建立了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)模型，以期為防御氧化應(yīng)激對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷提供依據(jù)。前期研究表明，H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)通過(guò)多種分子機(jī)制發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，涉及到幾條信號(hào)通路的激活。其中細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶2，以及JAK－STAT 和NF－κB 信號(hào)通路的激活均參與了這種適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)［1－3］。雖然H2O2預(yù)處理通過(guò)激活相關(guān)的分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用，但是何種效應(yīng)蛋白作為這種適應(yīng)性保護(hù)功能的執(zhí)行者卻尚未清楚。熱休克蛋白(heat－shock proteins，HSP)是機(jī)體面對(duì)多種應(yīng)激原如熱、活性氧、DNA 損傷、缺血、缺氧、炎癥刺激時(shí)，產(chǎn)生的一組能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)具有重要功能蛋白的蛋白質(zhì)，它的生理功能之一是對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞提供保護(hù)［4，5］。

磷脂酰肌醇3－激酶/Akt (phosphatidylinositol 3－kinase/Akt，PI3K/Akt)信號(hào)通路參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，是神經(jīng)元存活的主要途徑之一。我們最近的研究顯示，在PC12 細(xì)胞，H2O2預(yù)處理可引起Akt 活化，并且PI3K/Akt 通路的激活發(fā)揮了抗細(xì)胞凋亡的作用，參與H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)［6］。HSP 作為在眾多應(yīng)激情況下發(fā)揮保護(hù)作用的效應(yīng)蛋白，是否參與PI3K/Akt 信號(hào)通路介導(dǎo)的H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡作用，本文擬對(duì)此進(jìn)行探討。

材 料 和 方 法

1 材料

RPMI－1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco－BRL，小牛血清購(gòu)自HyClone。30% H2O2為Alfa Aesar 產(chǎn)品。Hoechst33258、胰蛋白酶、BSA、HEPES、EDTA、DMSO、碘化丙啶(propidium iodide，PI)、槲皮素(quercetin)、17－烯丙氨基－17－脫甲氧基格爾德霉素(17－allylamino－17－demethoxygeldanamycin，17－AAG)和LY294002 均購(gòu)自Sigma。HSP70、HSP90 抗體和化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham ECL Kit)購(gòu)自Cell Signaling Technology (CST);β－actin 及HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗為Santa Cruz 產(chǎn)品。BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce。Caspase－3 活性測(cè)定試劑盒為德國(guó)默克產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和預(yù)處理方法 PC12 細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。于37 ℃、5%CO2的條件下，用含10%馬血清和5%胎牛血清的RPMI－1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。H2O2預(yù)處理的實(shí)施方法如下:100 μmol/L H2O2作用PC12 細(xì)胞90 min 后，撤去H2O2，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h，再給予300 μmol/L H2O2作用12 h。PI3K 抑制劑LY294002(25 μmol/L)、HSP70 抑制劑quercetin(50μmol/L)和HSP90 抑制劑17－AAG(100 nmol/L)分別在預(yù)處理前30 min 加入培養(yǎng)液。

2.2 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

①Hoechst33258 染色觀(guān)察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化 細(xì)胞接種于培養(yǎng)板內(nèi)，按實(shí)驗(yàn)要求給以不同的處理因素，處理終止后棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用PBS 洗2 次，加入新鮮配制的4%多聚甲醛，4 ℃固定細(xì)胞10 min，PBS 沖洗1 次，加5 mg/L Hoechst 33258 避光染色10 min，PBS 沖洗2 次，熒光顯微鏡下觀(guān)察、攝片。

②PI 染色流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求給予不同因素處理后，離心收集細(xì)胞，PBS 洗2 次，加入預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定過(guò)夜。測(cè)定前離心棄去乙醇，細(xì)胞重懸于含有100 mg/L 碘化丙啶(PI)和2 ×104U/L RNase A 的染色液中，室溫避光染色30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率(激發(fā)波長(zhǎng):488 nm;發(fā)射波長(zhǎng):610 nm)。每樣本計(jì)數(shù)12 000 個(gè)細(xì)胞，采用熒光強(qiáng)度值并以Multicycle 軟件處理結(jié)果，計(jì)算凋亡率。

③Caspase－3 活性測(cè)定 Caspase－3 的活性測(cè)定根據(jù)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行，按實(shí)驗(yàn)分組給以不同的處理因素后，離心收集細(xì)胞，使用冰冷的PBS 洗滌細(xì)胞2次。裂解緩沖液(Tris－HCl 50 mmol/L，pH 7.4，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，1%Triton X－100)重懸細(xì)胞，冰上孵育20min，間以振蕩。細(xì)胞裂解物在4 ℃、10 000 ×g 離心5 min，取上清。進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。上清內(nèi)加入反應(yīng)試劑(HEPES 20 mmol/L，DTT 2 mmol/L，10% glycerin，pH 7.5)后，與caspase－3 的底物在37 ℃孵育4 h，405 nm 處測(cè)定吸光度值。

2.3 免疫印記法(Western blotting)檢測(cè)HSP70 和HSP90 的表達(dá) 經(jīng)實(shí)驗(yàn)因素處理后消化、離心收集細(xì)胞。冰冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次，再加入裂解緩沖液(50 mmol/L Tris－HCl，150 mmol/L NaCl，0.2 g/L NaN3，1 g/L SDS，1.0 mmol/L PMSF，5 mg/L aprotinin，1.0 g/L NP40，5.0 g/L 脫氧膽酸鈉，pH 8.0)振蕩混勻，冰浴30 min。離心細(xì)胞裂解物(4 ℃12 000×g 離心5 min)，取上清保存于－80 ℃。BCA 蛋白定量試劑盒用來(lái)進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整樣品的蛋白量進(jìn)行SDS－PAGE，電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(100 V 真空電轉(zhuǎn)移1 h)。PBST 溶液用來(lái)洗膜5 min。室溫下用含5%脫脂奶粉的PBST 溶液封閉PVDF 膜1 h。隨后加入Ⅰ抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。PBST 溶液洗膜3 次，每次5 min。加入相應(yīng)的Ⅱ抗(1∶1 000)，孵育1 h，漂洗3 次，每次5 min。將PVDF 膜用化學(xué)發(fā)光試劑ECL 染1 min，暗室中曝光到X 光片上。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS 14.0)分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用單因素方差分析(Oneway ANOVA)檢驗(yàn)，用最小有意義差異檢驗(yàn)(least significant difference，LSD 和SNK)進(jìn)行均數(shù)間的多重比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3－6 次。

結(jié) 果

1 LY294002 拮抗H2O2 預(yù)處理的抗細(xì)胞凋亡作用

1.1 凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化 結(jié)果顯示，正常生長(zhǎng)的PC12 細(xì)胞的胞核呈現(xiàn)彌散均勻熒光，核無(wú)固縮，為體積較大的淺染核形態(tài)，見(jiàn)圖1A;300 μmol/L 的H2O2作用12 h 后，細(xì)胞核的染色質(zhì)凝集、邊緣化，胞核染色質(zhì)裂解為塊狀，產(chǎn)生凋亡小體等典型的凋亡特征，見(jiàn)圖1B;預(yù)處理則明顯減少300 μmol/L H2O2引起細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖1C。而在預(yù)處理前給予LY294002 則可使凋亡細(xì)胞的數(shù)量增加，見(jiàn)圖1D。

1.2 Caspase－3 活性的變化 300 μmol/L H2O2引起PC12 細(xì)胞的caspase－3 活性顯著升高，提示H2O2誘導(dǎo)的凋亡依賴(lài)于caspase－3 的活化。H2O2預(yù)處理可以明顯降低300 μmol/L H2O2引起的caspase－3 活性升高，而ly294002 可以阻斷H2O2預(yù)處理降低caspase－3 活性的作用，見(jiàn)圖2。

2 Quercetin 和17－AAG 拮抗H2O2 預(yù)處理的抗細(xì)胞凋亡作用

2.1 凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化 Hoechst 33258 染色結(jié)果顯示，在H2O2預(yù)處理前分別給予quercetin 和17－AAG，拮抗了H2O2預(yù)處理引起的細(xì)胞保護(hù)作用，使凋亡細(xì)胞的數(shù)量增加，見(jiàn)圖3。

Figure 1. Effect of LY294002 on anti－apoptosis induced by H2O2 preconditioning(Hoechst 33258 staining，×200).The morphological changes of apoptotic cells were assessed by Hoechst 33258 staining. A:untreated cells (control);B:cells treated with 300 μmol/L H2O2 for 12 h;C:cells preconditioned with 100 μmol/L H2O2 for 90 min before treatment with 300 μmol/L H2O2;D:pretreatment with 25 μmol/L LY294002 30 min before H2O2 preconditioning.圖1 LY294002 對(duì)H2O2 預(yù)處理抗細(xì)胞凋亡的影響

Figure 2. Effect of LY294002 on inhibition of caspase－3 activity induced by H2O2 preconditioning(PC).Caspase－3 activity was detected by colorimetry. PC12 cells were treated with the indicated treatments and divided into 6 groups as previous description. ±s.n =6. ##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜0.01 vs H2O2 group;△△P ＜0.01 vs PC+ H2O2 group.圖2 LY294002 對(duì)H2O2 預(yù)處理抑制caspase－3 活性的影響

2.2 細(xì)胞凋亡率的變化 流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果顯示:PC12 細(xì)胞經(jīng)100 μmol/L H2O2預(yù)處理后，可使300 μmol/L H2O2引起的細(xì)胞凋亡率由(65.5±4.1)%下降至(37.1 ±2.3)%，P ＜0.01，而在H2O2預(yù)處理前分別給予quercetin 和17－AAG，細(xì)胞的凋亡率從(37.1±2.3)%上升至(53.6 ±5.2)%和(58.5 ±3.6)%，P ＜0.01，溶劑(quercetin 和17－AAG 的溶媒)處理沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，見(jiàn)圖4。

3 LY294002 對(duì)H2O2 預(yù)處理上調(diào)HSP70 和HSP90表達(dá)的影響

Western blotting 結(jié)果顯示，100 μmol/L H2O2和300 μmol/L H2O2均增加細(xì)胞內(nèi)HSP70 和HSP90 的表達(dá)，但在H2O2損傷前給予預(yù)處理能明顯提高細(xì)胞內(nèi)HSP70 和HSP90 的表達(dá)。而LY294002 抑制了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的HSP70 及HSP90 表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)圖5。

討 論

早期的研究發(fā)現(xiàn)，適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)作用是由預(yù)處理因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)所介導(dǎo)，抑制蛋白質(zhì)的合成則消除了這種保護(hù)作用［7］。而對(duì)預(yù)處理因素反應(yīng)的保護(hù)性蛋白質(zhì)的性質(zhì)在很大程度上是未知的。HSP 作為細(xì)胞內(nèi)最重要的分子伴侶，除參與細(xì)胞內(nèi)一些重要蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象及穩(wěn)定性調(diào)節(jié)之外，另一重要生理功能是對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞提供保護(hù)［4，5］。通常認(rèn)為HSP 可以通過(guò)阻斷細(xì)胞重要蛋白質(zhì)的變性及聚合而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用，但近年來(lái)的研究證實(shí)HSP 蛋白家族的重要成員如HSP70、HSP90 可以直接作用于細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制，在細(xì)胞的抗凋亡反應(yīng)中起著重要作用［8－10］。

Figure 3. Effects of quercetin and 17－AAG on anti－apoptosis induced by H2O2 preconditioning(Hoechst 33258 staining，×200).A:untreated cells (control);B:cells treated with 300 μmol/L H2O2 for 12 h;C:cells preconditioned with 100 μmol/L H2O2 for 90 min before treatment with 300 μmol/L H2O2;D:pretreatment with 50 μmol/L quercetin 30 min before H2O2 preconditioning;E:pretreatment with 100 nmol/L 17－AAG 30 min before H2O2 preconditioning;F:cells treated with vehicle.圖3 Quercetin 和17－AAG 對(duì)H2O2 預(yù)處理抗細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4. Effects of quercetin and 17－AAG on anti－apoptosis induced by H2O2 preconditioning(FCM assay). A:untreated cells(control);B:cells treated with 300 μmol/L H2O2 for 12 h;C:cells preconditioned with 100 μmol/L H2O2 for 90 min before treatment with 300 μmol/L H2O2;D:pretreatment with 50 μmol/L quercetin 30 min before H2O2 preconditioning;E:pretreatment with 100 nmol/L 17－AAG 30 min before H2O2 preconditioning;F:cells treated with vehicle. ±s.n=6. ＊＊P＜0.01 vs H2O2 group;##P ＜0.01 vs PC+ H2O2 group.圖4 Quercetin 和17－AAG 對(duì)H2O2 預(yù)處理抗細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5. Effect of LY294002 on up－regulation of HSP70 and HSP90 induced by H2O2 preconditioning.The expression of HSP70 and HSP90 were detected by Western blotting. PC12 cells were treated with the indicated treatments and divided into 6 groups as previous description. ±s.n=3. ##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜0.01 vs H2O2 group;△△P ＜0.01 vs PC+ H2O2 group.圖5 LY294002 對(duì)H2O2 預(yù)處理上調(diào)HSP70 和HSP90 表達(dá)的影響

本課題組最近的研究結(jié)果表明，PI3K/Akt 通路介導(dǎo)了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)作用［6］。本研究首先觀(guān)察了阻斷PI3K/Akt 通路對(duì)H2O2預(yù)處理抗凋亡作用的影響。細(xì)胞凋亡分析的結(jié)果顯示，高濃度的H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，H2O2預(yù)處理使PC12細(xì)胞提高對(duì)高濃度H2O2的抵抗能力，減少細(xì)胞的凋亡。但是在H2O2預(yù)處理前使用PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002，則拮抗了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡作用。Caspase－3 是凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終通路，H2O2預(yù)處理可以降低高濃度H2O2引起的caspase－3 活性升高，在預(yù)處理前使用LY294002 拮抗了這一作用，說(shuō)明PI3K/Akt 通路介導(dǎo)的H2O2預(yù)處理的抗細(xì)胞凋亡作用是通過(guò)抑制caspase－3 的活性而實(shí)現(xiàn)。為了觀(guān)察熱休克蛋白在H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡中的作用，分別在預(yù)處理前使用HSP70 和HSP90 的抑制劑quercetin 和17－AAG。對(duì)細(xì)胞凋亡的分析顯示，quercetin 和17－AAG 拮抗了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用，使細(xì)胞凋亡增加。

既然PI3K/Akt 通路和熱休克蛋白均參與了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用，為了明確HSP 是否參與PI3K/Akt 通路介導(dǎo)的這一抗細(xì)胞凋亡作用，在H2O2預(yù)處理前給予LY294002，觀(guān)察對(duì)HSP70 和HSP90 表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，H2O2(預(yù)處理劑量和損傷劑量)均可以引起HSP70 和HSP90 的表達(dá)升高，說(shuō)明在氧化應(yīng)激情況下，熱休克蛋白的表達(dá)增多可能作為機(jī)體的一個(gè)適應(yīng)性反應(yīng)。在高濃度H2O2損傷前給予預(yù)處理則明顯增加HSP70 和HSP90 的表達(dá)。有意思的是，使用LY294002 能夠明顯抑制H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的HSP70 和HSP90 表達(dá)上調(diào)，表明PI3K/Akt 通路介導(dǎo)了H2O2預(yù)處理增加HSP70 和HSP90 表達(dá)的作用。

在面對(duì)氧化應(yīng)激的挑戰(zhàn)中，一些分子信號(hào)事件和基因程序可以被激活，最終發(fā)展成為對(duì)氧化損傷的抵抗能力。本研究觀(guān)察到PI3K/Akt 通路和熱休克蛋白均參與H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用。PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002 在拮抗H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡作用的同時(shí)，也明顯地抑制HSP70 和HSP90 的表達(dá)，提示在H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)中，PI3K/Akt 通路的激活促進(jìn)了HSP70 和HSP90 的表達(dá)，而HSP70 和HSP90 作為PI3K/Akt 通路激活后的效應(yīng)蛋白，參與PI3K/Akt 介導(dǎo)的H2O2預(yù)處理的抗細(xì)胞凋亡作用。

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