吳順杰 (廣東省中醫(yī)院血液科,廣州510120)

輔助性T細(xì)胞(Th)及其分泌的細(xì)胞因子在急性移植物抗宿主病(aGVHD)的發(fā)生、發(fā)展及維持的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[1],按其分泌的細(xì)胞因子的不同,Th亞群分為T(mén)h1和Th2。調(diào)整Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡在防治aGVHD中具有良好的臨床應(yīng)用前景。筆者在以往的論文中指出解毒法是中醫(yī)藥防治aGVHD的重要治療原則,應(yīng)貫穿aGVHD治療的始終[2]。在本研究中,筆者以aGVHD小鼠為模型,應(yīng)用具有清熱解毒作用的中藥安腦片干預(yù)治療后,觀(guān)察小鼠外周血液中的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-10水平以及肝臟組織中IFN-γ和IL-10陽(yáng)性表達(dá)情況的變化,以探討aGVHD小鼠Th1/Th2的表達(dá)情況及安腦片對(duì)Th1/Th2細(xì)胞因子的影響,以期揭示安腦片干預(yù)aGVHD發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。供鼠:清潔級(jí)BALB/c H-2d小鼠10只,8～ 10周齡,雄性,體重(20±2)克 ;受鼠:清潔級(jí)C57BL/6 H-2b小鼠 20只,10～12周齡,雌性,體重(20±2)克。小鼠在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)籠中飼養(yǎng)。

1.2 藥劑制備 安腦片:哈爾濱東方制藥生產(chǎn),薄膜衣片,0.5 g/片,主要成份:人工牛黃、水牛角濃縮粉、豬膽汁粉、黃連、黃芩、郁金、珍珠母、珍珠、雄黃、冰片、朱砂、薄荷腦等15味藥物組成,攻效:清熱解毒。上藥購(gòu)自廣東省中醫(yī)院中藥房,生產(chǎn)批號(hào)為:20100701,灌胃前用0.9%生理鹽水臨時(shí)配成藥液,配藥濃度為0.1 g/ml。分裝成100 ml瓶備用,以便動(dòng)物灌服。

1.3 模型制作、分組及處理 將20只C57BL/6小鼠按照文獻(xiàn)[3]的方法制作模型,然后隨機(jī)分為空白組及安腦片組,每組10只,處理如下:(1)安腦片組:小鼠給予安腦片藥液0.2 ml/只,每天分2次灌胃,從移植后第1天開(kāi)始用藥,用至第30天。(2)空白組的處理:均給予0.9%生理鹽水灌胃,用法、用量、次數(shù)、給藥天數(shù)與其他3組相同。第30天斷頸處死,留取標(biāo)本用于檢測(cè),空白組小鼠則在小鼠瀕臨死亡時(shí)留取標(biāo)本。

1.4 主要儀器與試劑 ELISA檢測(cè)試劑盒(法國(guó)Diaclone公司)。兔抗人白細(xì)胞介素(IL)-10、干擾素(IFN)-γ單克隆抗體以及SABC試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。磷酸鹽緩沖液(PBS),倒置相差顯微鏡(Leica公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國(guó))。OLYMPUS倒置顯微鏡(CK-2,日本)。OLYMPUS照相系統(tǒng)(PM-CBAD,日本),病理切片機(jī)。PPCT-ZB型超聲波多功能快速組織脫水機(jī)(襄樊徠卡生物電子儀四廠(chǎng)生產(chǎn))。OCT包埋劑。

1.5 ELISA法檢測(cè)小鼠血清IFN-γ及IL-10水平

嚴(yán)格按試劑盒和酶標(biāo)儀說(shuō)明書(shū)提示的步驟進(jìn)行操作,具體操作如下:(1)移植后第30天,取小鼠眶靜脈血,離心后取其上清。(2)酶標(biāo)的生物素抗體。(3)加入酶的底物發(fā)生顯色反應(yīng)。(4)酶標(biāo)儀450 nm讀取吸光度(A)值。(5)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品曲線(xiàn)計(jì)算樣品的IFN-γ和IL-10的含量。

1.6 免疫組化法檢測(cè)肝臟組織IFN-γ及IL-10的陽(yáng)性表達(dá)

1.6.1 免疫組化標(biāo)本的制作 移植后第30天,取兩組小鼠肝臟各2塊,放入10%中性甲醛固定,丙酮脫水、石蠟包埋,全部蠟塊均行4μm連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟,梯度乙醇水洗,3%甲醇過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,室溫置10分鐘,PBS沖洗。滴加正常山羊血清,37℃30分鐘。滴加一抗4℃過(guò)夜(一抗?jié)舛葹?∶100),PBS沖洗。滴加生物素化二抗,37℃孵育30分鐘,PBS沖洗。加SABC液37℃1小時(shí),PBS沖洗。DAB顯色,室溫下 3～10分鐘。水洗,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,明膠封片。

1.6.2 結(jié)果判定 通過(guò)兩位有5年以上經(jīng)驗(yàn)的臨床病理學(xué)家采用雙盲法判斷結(jié)果,每張切片選擇有代表性的區(qū)域,并避開(kāi)切片周邊區(qū)域,觀(guān)察組織IFN-γ、IL-10的陽(yáng)性表達(dá),根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)[4]。兩組計(jì)分相加,0～1分為陰性,2～3分為弱陽(yáng)性,4～5分為陽(yáng)性,6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性。陽(yáng)性分級(jí)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清中 IFN-γ、IL-10表達(dá) 治療前,兩組小鼠IFN-γ的表達(dá)分別為(9.56±0.71)pg/ml與(9.67±0.88)pg/ml,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)明顯差異(P=0.345),經(jīng)安腦片干預(yù)治療后,安腦片組小鼠血清IFN-γ的表達(dá)降為4.81±0.87,與治療前相比差異顯著(P=0.000),而空白組IFN-γ的表達(dá)水平下降不明顯(P=0.597),見(jiàn)表2。

治療前,兩組小鼠IL-10的濃度分別為(3.62±0.59)pg/ml和(3.81±0.55)pg/ml,差異無(wú)顯著性意義(P=0.524)。安腦片治療后,IL-10的表達(dá)升至(8.16±0.92)pg/ml,與治療前相比,差異顯著(P=0.000)。而空白組IL-10的表達(dá)水平變化不大(P=0.150),見(jiàn)表 3。

2.2 免疫組化法檢測(cè)小鼠肝臟IFN-γ的表達(dá)

表1 免疫組織化學(xué)陽(yáng)性分級(jí)Tab.1 Tissue immunochemical score criteria

2.2.1 小鼠肝臟組織IFN-γ的表達(dá) aGVHD小鼠肝臟炎性細(xì)胞胞漿IFN-γ的表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀物質(zhì),陽(yáng)性細(xì)胞占95%以上,提示病理組織 IFN-γ的表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(圖1A)。經(jīng)安腦片治療后,小鼠肝臟炎性細(xì)胞胞漿IFN-γ的表達(dá)呈現(xiàn)淡黃色顆粒狀物質(zhì)或未染色(圖1B),陽(yáng)性細(xì)胞約占5%～10%。

2.2.2 小鼠肝臟組織IFN-γ的表達(dá)評(píng)分結(jié)果 治療前兩組肝臟IFN-γ的表達(dá)評(píng)分分別為3.73±0.46和3.80±0.41,兩組間的差異無(wú)顯著性意義。經(jīng)安腦片治療后,安腦片組小鼠IFN-γ的表達(dá)評(píng)分降為1.27±0.46,與治療前相比,差異有顯著性意義(P=0.000)?？瞻捉MIFN-γ的表達(dá)則變化不明顯(P=0.189),見(jiàn)表 4。

2.3 免疫組化法檢測(cè)小鼠肝臟IL-10的表達(dá)

2.3.1 小鼠肝臟 IL-10的表達(dá) aGVHD小鼠肝臟炎性細(xì)胞胞漿IL-10的表達(dá)呈現(xiàn)淡黃色或淺黃色顆粒狀物質(zhì),陽(yáng)性細(xì)胞約占10%～40%,提示肝臟組織IL-10的表達(dá)呈現(xiàn)弱陽(yáng)性或陰性反應(yīng)(圖2A)。經(jīng)安腦片治療后,安腦片組小鼠肝臟炎性細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色,陽(yáng)性細(xì)胞約占80%～95%(圖2B),呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。

2.3.2 小鼠肝臟組織IL-10的表達(dá)評(píng)分結(jié)果 治療前兩組肝臟IL-10的表達(dá)評(píng)分分別為1.27±0.46和1.20±0.41,兩組間的差異無(wú)顯著意義。經(jīng)安腦片治療后,安腦片組小鼠IL-10的表達(dá)評(píng)分升至3.73±0.46,與治療前相比差異顯著(P=0.000)?？瞻捉MIL-10的表達(dá)有所上升,但與治療前相比,差異不明顯(P=0.055),見(jiàn)表 5。

表2 兩組小鼠血清中IFN-γ的表達(dá)水平(±s,pg/ml)Tab.2 Expression of IFN-γin blood serum sample of two group( ±s,pg/ml)

表2 兩組小鼠血清中IFN-γ的表達(dá)水平(±s,pg/ml)Tab.2 Expression of IFN-γin blood serum sample of two group( ±s,pg/ml)

Groups Number Before treatment After treatment t P(2-tailed)Blank group 15 9.56±0.71 9.64±0.72 -0.542 0.597 Control group 15 9.67±0.88 4.81±0.87 17.768 0.000

表3 兩組小鼠血清中IL-10的表達(dá)水平±s,pg/ml)Tab.3 Expression of IL-10 in blood serum sample of two group±s,pg/ml)

表3 兩組小鼠血清中IL-10的表達(dá)水平±s,pg/ml)Tab.3 Expression of IL-10 in blood serum sample of two group±s,pg/ml)

Groups Number Before treatment After treatment t P(2-tailed)Blank group 15 3.62±0.59 3.77±0.50 -1.522 0.150 Control group 15 3.81±0.55 8.16±0.92 -13.557 0.000

表4 兩組小鼠肝臟IFN-γ的表達(dá)陽(yáng)性評(píng)分±s)Tab.4 Immunochemical positive scoring results of IFN-γin liver sample of mice(±s)

表4 兩組小鼠肝臟IFN-γ的表達(dá)陽(yáng)性評(píng)分±s)Tab.4 Immunochemical positive scoring results of IFN-γin liver sample of mice(±s)

Groups Number Before treatment After treatment t P(2-tailed)Blank group 15 3.73±0.46 3.53±0.52 1.382 0.189 Control group 15 3.80±0.41 1.27±0.46 19.000 0.000

圖1 小鼠肝臟IFN-γ的表達(dá)(HE,×400)Fig.1 Expression of IFN-γin liver sample of mice(HE,×400)

圖2 小鼠肝臟IL-10的表達(dá)(HE,×400)Fig.2 Expression of IL-10 in liver sampleof mice(HE,×400)

表5 兩組小鼠肝臟IL-10的表達(dá)陽(yáng)性評(píng)分(±s)Tab.5 Immunochemical positive scoring results of IL-10 in liver sample of mice(±s)

表5 兩組小鼠肝臟IL-10的表達(dá)陽(yáng)性評(píng)分(±s)Tab.5 Immunochemical positive scoring results of IL-10 in liver sample of mice(±s)

Groups Number Before treatment After treatment t P(2-tailed)Blank group 15 1.27±0.46 1.60±10.51 -2.092 0.055 Control group 15 1.20±0.41 3.73±0.46 -13.201 0.000

3 討論

IFN-γ是參與aGVHD第二步驟的關(guān)鍵因子,它在aGVHD的早期階段產(chǎn)生,能上調(diào)MHC和粘附分子表達(dá),激活單核細(xì)胞發(fā)揮抗原提呈作用,誘導(dǎo)CD4+淋巴細(xì)胞分化成熟,增加Ⅰ類(lèi)細(xì)胞因子的分泌,激活CTL,加強(qiáng)同種異體抗原刺激下的混合淋巴細(xì)胞 反 應(yīng)[5]。但 Welniak 等[6]和 Jean-Sébastien Delisle等[7]的研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ在aGVHD致死方面起保護(hù)作用。我們的研究結(jié)果顯示:發(fā)生aGVHD后,兩組小鼠血清IFN-γ的表達(dá)水平上升,分別為(9.56±0.71)pg/ml與(9.67±0.88)pg/ml,這與文獻(xiàn)[8,9]報(bào)道的情況相似。免疫組織化學(xué)的研究結(jié)果顯示,aGVHD小鼠肝臟組織中IFN-γ的表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀物質(zhì),陽(yáng)性細(xì)胞占95%以上,兩組小鼠肝臟IFN-γ的表達(dá)評(píng)分分別為 3.73±0.46和3.80±0.41,兩者的差異并不顯著,這與以往的文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10]。而在安腦片治療后,小鼠血清IFN-γ的表達(dá)降至(4.81±0.87)pg/ml,小鼠肝臟組織IFN-γ的表達(dá)呈現(xiàn)淡黃色顆粒狀物質(zhì)或未染色,陽(yáng)性細(xì)胞約占5%～10%,呈現(xiàn)弱陽(yáng)性反應(yīng),其表達(dá)評(píng)分也降為1.27±0.46,與治療前相比,差異顯著(P=0.000)。這說(shuō)明安腦片在降低aGVHD小鼠血清IFN-γ的表達(dá)水平及肝臟組織IFN-γ的陽(yáng)性表達(dá)方面起積極作用。

IL-10是由活化的巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和Th2細(xì)胞產(chǎn)生,具有下調(diào)Th1類(lèi)細(xì)胞因子的作用,可抑制單核巨噬細(xì)胞的炎癥效應(yīng)及IL-2、IFN-γ、TNF-α等Th1類(lèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生[11],還可通過(guò)下調(diào)單核細(xì)胞表面MHCⅡ類(lèi)分子和T淋巴細(xì)胞激活所必需的共刺激分子B7的表達(dá)而抑制其抗原提呈功能的發(fā)揮[12],因此上調(diào)IL-10表達(dá)水平,抑制IFN-γ等Th1類(lèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生,是阻止aGVHD發(fā)生和發(fā)展的策略之一。本研究的結(jié)果顯示:發(fā)生aGVHD后,小鼠血清中IL-10的表達(dá)水平降低,分別為(3.62±0.59)pg/ml和(3.81±0.55)pg/ml,兩組的濃度變化不明顯。免疫組化顯示小鼠肝臟組織中IL-10的表達(dá)呈現(xiàn)淡黃色或淺黃色顆粒狀物質(zhì),陽(yáng)性細(xì)胞約占10%～40%,其表達(dá)評(píng)分分別為1.27±0.46和1.20±0.41,提示移植小鼠發(fā)生aGVHD后IL-10的表達(dá)水平是下降的,這與文獻(xiàn)[13]的報(bào)道一致。而經(jīng)過(guò)安腦片治療后,IL-10表達(dá)升至(8.16±0.92)pg/ml,小鼠肝臟組織呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),陽(yáng)性細(xì)胞約占80%～95%,其表達(dá)的評(píng)分也升至3.73±0.46,與治療前相比差異顯著(P=0.000),這提示安腦片可提高aGVHD小鼠IL-10的表達(dá)水平。

由此看出,安腦片通過(guò)降低aGVHD小鼠IFN-γ的表達(dá),同時(shí)提高IL-10的含量,從而保持了Th1/Th2細(xì)胞間的平衡,調(diào)節(jié)和控制aGVHD的發(fā)生。為什么具有清熱解毒作用的安腦片能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞間的平衡呢?筆者從其組成藥物的現(xiàn)代藥理研究來(lái)解釋。中藥的現(xiàn)代藥理研究表明,方中雄黃具有解毒、殺蟲(chóng)、燥濕、祛風(fēng)等功能,其主要成分為四硫化四砷(AS4S4)和三硫化二砷(AS2S3),能夠抑制大鼠血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α等Th1類(lèi)細(xì)胞因子的釋放[14]。牛黃的主要成分?；撬?具有解熱鎮(zhèn)痛等功效,對(duì)炎癥的各個(gè)階段均有顯著的抑制作用,可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能[15]。安腦片中還有水牛角、黃芩、黃連、珍珠等藥物,對(duì)炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ等都有明顯的抑制作用[16-19]。正是安腦片組成藥物及其成分對(duì)炎癥細(xì)胞因子的抑制作用,減少了細(xì)胞因子的產(chǎn)生或功能的發(fā)揮,起到明顯干預(yù)aGVHD的效果。至于安腦片干預(yù)小鼠aGVHD效應(yīng)是否存在其他機(jī)制,需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

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