李亮亮 柴 曄 張連生 吳重陽 曾鵬云 李莉娟 易良才 (蘭州大學(xué)第二醫(yī)院血液科,蘭州730030)

白血病源樹突狀細(xì)胞(DC)與正常DC相比,其形態(tài)及免疫表型相似,但抗原提呈功能較弱,在大多數(shù)患者體內(nèi)并不能產(chǎn)生預(yù)想的有效的抗白血病細(xì)胞毒作用[1]。如何提高DC表面共刺激分子的表達(dá)及增強(qiáng)DC的抗原提呈功能成為近來大多數(shù)研究的焦點(diǎn),然而,并不只有共刺激分子參與免疫應(yīng)答的介導(dǎo),免疫反應(yīng)的觸發(fā)還有賴于趨化因子,尤其是樹突狀細(xì)胞趨化因子1(DC-CK1),對啟動(dòng)初始免疫應(yīng)答發(fā)揮關(guān)鍵作用。DC-CK1是主要由DC和單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)的一種趨化因子,與 RANTES、MIP-1α和IL-8等多種趨化因子不同,其主要選擇性趨化初始T細(xì)胞(CD45RA+),而記憶T細(xì)胞(CD45RO+)不能被DC-CK1吸引,DC-CK1對初始B細(xì)胞(CD38-)亦具有趨化性,故其是免疫反應(yīng)的始動(dòng)者[2]。現(xiàn)有研究還發(fā)現(xiàn),DC-CK1在抗腫瘤及疫苗佐劑等方面具有重要作用,因此檢測白血病源DC表達(dá)的DC-CK1的水平對于研究白血病源DC的抗腫瘤效應(yīng)和治療都具有重要意義。關(guān)于體外誘導(dǎo)的白血病源DC尤其是多種白血病源DC表達(dá)DC-CK1的研究目前尚無報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)將對白血病源DC分泌的DC-CK1進(jìn)行初步的研究,為今后探索其在白血病源DC介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)作用創(chuàng)造有利條件,并為優(yōu)化白血病的免疫治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇蘭州大學(xué)第二醫(yī)院血液科初診未治的25例白血病患者,年齡10～48歲,中位年齡29歲,入選病例的診斷和分期均符合張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。AML患者10例,其中M2 4例,M3 2例,M4 3例,M5 1例;ALL患者 7例;外周血原始細(xì)胞百分?jǐn)?shù)38%～96%。CML患者8例,血常規(guī)白細(xì)胞為(57～540)×109L-1,染色體核型檢查Ph陽性率為 100%。健康志愿者 10例,年齡20～46歲,中位年齡31歲。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基:美國Gibco公司產(chǎn)品,配制按說明書,4℃保存。胎牛血清:杭州四季青生物制品公司產(chǎn)品,56℃30分鐘滅活后分裝,-20℃凍存?zhèn)溆?。rhGM-CSF及rhIL-4為廈門特寶生物工程公司提供,TNF-α購自 PeproTech公司。CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR 單抗均購自美國Caltag公司。RT-PCR試劑盒購自Roche公司。人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白4(MIP-4)試劑盒購自美國R&D公司。

1.3 DC的誘導(dǎo)培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[3],稍做修改。用無菌肝素抗凝管采集白血病患者及正常人外周血10 ml,PBS液等量稀釋,經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心,獲取單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),用PBS緩沖液洗滌2次,棄去上清,用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106ml-1,接種于24孔培養(yǎng)板中,每孔1 ml,置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí),棄去懸浮細(xì)胞,在貼壁細(xì)胞中加入培養(yǎng)液,并加入rhGM-CSF 100 ng/ml、rhIL-4 100 ng/ml,吹打混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。隔日半量換液并添加首次劑量1/2的細(xì)胞因子,在倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。培養(yǎng)第6天,加入TNF-α100 ng/ml,第8天收獲細(xì)胞。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞在加入細(xì)胞因子后形態(tài)發(fā)生了明顯的變化,在倒置顯微鏡下逐日觀察,并收集第3及8天的細(xì)胞懸液,離心后涂片、自然干燥,進(jìn)行Wright染色鏡檢。

1.5 免疫表型檢測 流式細(xì)胞儀檢測DC的表面標(biāo)志,培養(yǎng)8天后的細(xì)胞用PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1～5×106ml-1,取細(xì)胞懸液100 μl/管,分別加入鼠抗人HLA-DR、CD80、CD86、CD83 及 CD1a單抗,混勻后4℃避光孵育30分鐘,再用PBS液離心洗滌2次,以1%多聚甲醛固定細(xì)胞20分鐘后上機(jī)檢測,分析軟件為CellQuest。

1.6 DC-CK1mRNA的RT-PCR分析 Trizol法從培養(yǎng)8天的細(xì)胞中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。DC-CK1mRNA 引物上游:5′CCTCTGCTCCTGTGCACAAGT-3′,下游 :5′TGCAGCTCAACAATAGAAATCAATT-3′,擴(kuò)增片段為424 bp;內(nèi)參照GAPDH引物上游:5′GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′,下 游:5′GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′,擴(kuò)增片段為214bp,反應(yīng)體系50μl,擴(kuò)增條件:94℃變性30秒,60℃退火40秒,72℃延伸1分鐘,34個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10分鐘。各取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物,以2%瓊脂糖凝膠電泳。半定量分析通過成像系統(tǒng)軟件Quantity One,計(jì)算DCCK1mRNA的吸光度值與內(nèi)參照A值的比值。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中DC-CK1濃度的ELISA測定

采用雙抗體夾心ELISA法檢測DC培養(yǎng)上清液中DC-CK1的含量,具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行,顯色后通過WALLAC VICTOR-1420多功能時(shí)間分辨免疫分析系統(tǒng)檢測。

2 結(jié)果

2.1 DC的形態(tài)觀察 新分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞呈圓形,大小均等,分散分布,加入GM-CSF及IL-4后細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)改變。培養(yǎng)第3天,細(xì)胞數(shù)量增多,聚集生長,形成多個(gè)小細(xì)胞團(tuán),細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,少數(shù)細(xì)胞周圍出現(xiàn)細(xì)小的毛刺,部分細(xì)胞懸浮;培養(yǎng)第6天,不規(guī)則形細(xì)胞增多,細(xì)胞團(tuán)的直徑增大,細(xì)胞邊緣的突起變長,懸浮細(xì)胞增多;培養(yǎng)第8天(加入TNF-α 2天),大部分細(xì)胞呈懸浮狀,細(xì)胞周圍可見大量較長而粗的樹枝樣棘突,呈現(xiàn)典型的DC形態(tài),各組DC的形態(tài)變化相似,以下是AML-DC的形態(tài)圖(圖1)。

2.2 DC免疫表型結(jié)果 白血病源DC與正常人DC表達(dá)的 DC 免疫標(biāo)記 CD80、CD86、CD83、CD1a及HLA-DR以流式細(xì)胞儀檢測沒有明顯差別,其陽性細(xì)胞比例見表1。

2.3 DC-CK1mRNA的RT-PCR檢測結(jié)果 采用RTPCR技術(shù)從核酸水平檢測DC-CK1的表達(dá)水平,AML-DC、CML-DC和ALL-DC中 DC-CK1mRNA的表達(dá)水平分別為0.26±0.025、0.27±0.020和0.29±0.034,均明顯低于正常DC(0.43±0.032),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

表1 白血病源DC和正常DC的免疫表型分析(±s,%)Tab.1 Immunophenotype of leukemia-DC and normal DC(±s,%)

表1 白血病源DC和正常DC的免疫表型分析(±s,%)Tab.1 Immunophenotype of leukemia-DC and normal DC(±s,%)

Groups n CD80 CD83 CD86 CD1a HLA-DR Normal-DC 10 74.76±11.23 82.08±11.73 78.14±11.54 73.05±13.57 81.55±10.40 AML-DC 10 72.20±10.63 81.49±11.05 77.01±8.96 70.32±13.14 78.15±10.41 CML-DC 8 71.44±11.30 79.46±13.41 76.56±10.03 68.78±12.29 77.39±10.31 ALL-DC 7 69.66±10.09 76.98±11.73 73.43±11.49 66.75±10.88 73.06±11.48 F 0.325 0.301 0.288 0.373 0.888 P 0.807 0.825 0.833 0.773 0.458

圖1 AML-DC的形態(tài)變化圖(瑞氏-染色,×1 000)Fig.1 Morphology changes of AML-DC(Wright-staining,×1 000)

圖2 RT-PCR檢測白血病源DC與正常DC的DCCK1mRNA表達(dá)水平Fig.2 Expression of DC-CK1mRNA in leukemia-DCand normal DC detected by RT-PCR

2.4 DC-CK1的ELISA檢測結(jié)果 應(yīng)用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中DC-CK1的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)白血病源DC表達(dá)的DC-CK1的水平同樣比正常DC明顯降低,AML-DC組:(152.32±34.74)pg/ml(n=10);CML-DC組:(163.06±40.97)pg/ml(n=8);ALL-DC組:(173.80±40.44)pg/ml(n=7);正常-DC組:(320.55±39.93)pg/ml(n=10),白血病各組之間無顯著性差異(P＜0.05),但各白血病組與正常對照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3。

圖3 ELISA檢測白血病源DC與正常DC上清中DC-CK1的分泌水平Fig.3 Secretion level of DC-CK1 in supernatants of leukemia-DC and normal DC detected by ELISA

3 討論

DC-CK1是1997年由Adema等人[4]首次在DC文庫發(fā)現(xiàn)其cDNA,故命名之,也可稱肺部活化調(diào)節(jié)趨化因子(PARC)、選擇性巨噬細(xì)胞活化相關(guān)的CC組趨化因子-1(AMAC-1)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白4(MIP-4)及趨化因子配體18(CCL-18),其受體和鼠的同系物到目前為止還不太清楚,故對DC-CK1的研究相對較少。DC-CK1除了具有誘導(dǎo)初始免疫反應(yīng)的獨(dú)特生物學(xué)特性外,尚具有抗腫瘤及疫苗佐劑的特性。Akiko等人[5]將人DC-CK1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞(CHO),發(fā)現(xiàn)與僅接受細(xì)菌載體的CHO細(xì)胞比較,轉(zhuǎn)基因CHO細(xì)胞的增殖明顯被抑制,證實(shí)了DC-CK1通過趨化并激活初始T細(xì)胞具有抑制腫瘤生長的作用。另外Bruna-Romero等人報(bào)道[6],DCCK1在小鼠體內(nèi)與瘧疾疫苗共同作用時(shí)能夠增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng),而由DC激活的CD8+T細(xì)胞對于阻止白血病的復(fù)發(fā)至關(guān)重要[7]。因此,了解體外誘導(dǎo)的白血病源DC表達(dá)的DC-CK1水平對于設(shè)計(jì)有效的抗白血病DC疫苗具有非常深遠(yuǎn)的意義。

DC成熟對DC-CK1產(chǎn)生的影響在多數(shù)研究中仍存在一些爭論,有些研究提出隨著DC的成熟,DC-CK1的分泌逐漸下調(diào),而另一些研究則認(rèn)為DC成熟增加DC-CK1mRNA的表達(dá)水平[2]。基于上述研究,本實(shí)驗(yàn)通過誘導(dǎo)白血病源DC產(chǎn)生,了解DCCK1的mRNA與蛋白質(zhì)水平的變化趨勢是否一致,以明確成熟的白血病源DC表達(dá)的DC-CK1的水平是升高還是降低。我們通過細(xì)胞形態(tài)及免疫表型證實(shí),AML、ALL及CML三種細(xì)胞在體外均能夠誘導(dǎo)成DC,且各型白血病源DC的形態(tài)變化及表面標(biāo)志與正常DC相似,這與多數(shù)研究結(jié)果一致[3,8,9]。需要提出的一點(diǎn)是,由于白血病細(xì)胞具有特異的異常核型及表面異常表達(dá)某些分子,在培養(yǎng)后仍有保留,故與正常DC相比,白血病源DC通常表達(dá)而正常DC不表達(dá)的特異表面分子或異常核型,這是二者的不同之處。在此基礎(chǔ)上,運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對白血病源DC的DC-CK1mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示成熟的白血病源DC其DC-CK1mRNA的表達(dá)量降低。采用ELISA法測定培養(yǎng)上清中DC-CK1的含量,結(jié)果表明DC-CK1的分泌受到限制,含量明顯下降,這說明DC-CK1mRNA表達(dá)水平的降低與趨化因子蛋白分泌的抑制是一致的,研究結(jié)果與Vulcano等人[10]的報(bào)道基本相符,他們運(yùn)用Northern blot和ELISA法對DC-CK1的表達(dá)水平進(jìn)行了分析,顯示mRNA水平與蛋白質(zhì)水平的變化趨勢一致,均為降低。研究結(jié)果顯示無論從核酸水平還是蛋白質(zhì)水平來看,白血病源DCs表達(dá)的DC-CK1的水平明顯低于正常DC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),這就提示白血病微環(huán)境中的某些因素可能抑制了DC-CK1的分泌。

Motta等人[11]的最新報(bào)道表明,在DC的體外分化過程中白血病細(xì)胞產(chǎn)物能夠刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的TNF-α及 IL-1β等細(xì)胞因子。TNF-α及IL-1β是由單核細(xì)胞產(chǎn)生的典型的炎性細(xì)胞因子[12],當(dāng)單核細(xì)胞分化為DC時(shí),二者的水平均降低,但當(dāng)白血病細(xì)胞如K562上清存在時(shí)二者的表達(dá)水平明顯增加。而有研究表明TNF-α與 IL-1β及其他因子如LPS、CD40L或RANKL等均能夠促進(jìn)DC的成熟,但其均抑制DC-CK1的產(chǎn)生[10,13]。故考慮雖然產(chǎn)生的白血病源DC可能是成熟的,但其DC-CK1的分泌將在內(nèi)源性抑制因子的作用下受到限制,因此推測白血病源DC表達(dá)的DC-CK1的水平比正常DC低,我們的研究結(jié)果與這一推測相符。由于本實(shí)驗(yàn)對內(nèi)源性TNF-α及IL-1β的水平?jīng)]有進(jìn)行檢測,關(guān)于二者對DC-CK1的影響尚不確定,故需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。DC-CK1的抑制意味著白血病源DC對初始T細(xì)胞的趨化性減弱,刺激T細(xì)胞的能力降低,最終可能導(dǎo)致白血病源DC的抗原提呈能力比正常DC弱。這就為我們從特殊的趨化因子這條途徑研究白血病源DC的抗腫瘤能力提供了新的依據(jù)。

總之,DC-CK1是一類特殊的趨化因子,能夠誘導(dǎo)初始免疫反應(yīng),在DC介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)中占有重要的地位,其抑制可能有助于腫瘤的存活。因此,本實(shí)驗(yàn)通過對白血病源DC表達(dá)的DC-CK1進(jìn)行研究,為今后通過各種方法利用DC-CK1來增強(qiáng)DC的抗白血病效應(yīng)提供了可靠的理論基礎(chǔ),對發(fā)展及改善白血病的免疫治療具有重要的臨床價(jià)值。

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