江益平 徐曉飛 周 聯(lián) 白莎莎 董 燕 (廣州中醫(yī)藥大學(xué)免疫研究室,廣州510405)

香菇多糖是臨床常用的腫瘤輔助治療用藥,研究表明香菇多糖是有效的T細(xì)胞激活劑,能有效地活化T細(xì)胞,誘導(dǎo)IL-2的分泌,激活NK細(xì)胞,增強腫瘤患者TH細(xì)胞和TC細(xì)胞的功能,使機體通過免疫功能有效地抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[1,2]。

DTH是依賴T細(xì)胞的細(xì)胞免疫反應(yīng),其主要特征是致敏機體在抗原攻擊部位出現(xiàn)遲發(fā)型炎癥反應(yīng),參與此免疫應(yīng)答的細(xì)胞主要是CD4+Th1細(xì)胞,也稱作為TD細(xì)胞。傳統(tǒng)的DTH實驗是DNFB半抗原的背部或腹部致敏,耳廓攻擊,通過耳腫脹程度從而反映機體T細(xì)胞免疫應(yīng)答水平的高低。本實驗在對比耳腫脹度的基礎(chǔ)上,著重觀察參與DTH反應(yīng)的主要淋巴結(jié)——右耳后淋巴結(jié)(Retroauricular lymph nodes,RLN)以及小腸派氏結(jié)(Peyer's patch,PP)中T淋巴細(xì)胞比例和活化情況,對比口服和腹腔注射香菇多糖對小鼠兩處淋巴結(jié)中T細(xì)胞的變化,探討腸道粘膜免疫在機體整體免疫中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 動物 NIH 小鼠,雄性,6～8周齡,體重18～22克,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供,動物許可證號:SCXK(粵)2006-0015。

1.2 藥物、試劑和主要儀器 香菇多糖噴干粉由無限極(中國)有限公司提供,硫酸-苯酚法結(jié)合3,5-二硝基水楊酸比色定糖法檢測多糖含量為52%[3];環(huán)磷酰胺(Cyclophosp homide,CY),江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號H32020875;2,4-二硝基氟苯(DNFB)為日本東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品;PE-Cy7-anti-mouse CD3,FITC-anti-mouse B220、PE-anti-mouse CD25和FITC-antimouse CD69為eBioscience產(chǎn)品;其它試劑均為進(jìn)口分析純或國產(chǎn)分析純試劑;電子分析天平,德國Sartorius產(chǎn)品,d=0.1 mg;臺式冷凍高速離心機,美國Beckman產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀,美國BD公司產(chǎn)品。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組、造膜與給藥 28只NIH小鼠按體重隨機分成4組,正常組(7只),模型組(7只),香菇多糖灌胃組(7只),香菇多糖注射組(7只)。正常組和模型組灌胃純水0.2 ml/(10 g?d),香菇多糖灌胃組灌胃香菇多糖800 mg/(kg?d),香菇多糖注射組腹腔注射香菇多糖800(mg/kg?d)。在給藥的第二天,各組小鼠的背部脫毛劑脫毛1 cm×1 cm,脫毛后的第二天,脫毛區(qū)用5%DNFB丙酮20μl涂抹致敏小鼠。給藥的第四天,正常組腹腔注射生理鹽水0.2 ml/10 g,其余各組均注射環(huán)磷酰胺85 mg/kg。給藥的第七天,各組小鼠的右耳用1%DNFB進(jìn)行攻擊,左耳用丙酮做對照。

1.4.2 耳片的制備 攻擊后30小時,各組小鼠脫頸椎處死,剪下左右耳廓,以耳廓中心位置打出直徑8.5 mm的圓形耳片。電子分析天平稱取左右耳片質(zhì)量,并以“右耳質(zhì)量(mg)-左耳質(zhì)量(mg)”計算各組小鼠耳腫脹度。

1.4.3 淋巴細(xì)胞的分離 取出各組小鼠的右耳后淋巴結(jié)和小腸派氏結(jié),分別置于盛有冷PBS的無菌培養(yǎng)皿中。用注射器針芯在120目篩網(wǎng)上擠壓淋巴結(jié),PBS沖洗篩網(wǎng)后收集培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸液。冷PBS洗滌細(xì)胞兩次1 000 r/min,4℃,10分鐘離心后,細(xì)胞計數(shù),將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×107ml-1。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測 從上述制備的淋巴細(xì)胞懸液中各取出100μl置于兩套流式管中,其中一套加入 PE-Cy7-anti-mouse CD3 0.25μg和FITC-antimouse B220 0.5μg;另外一套加入PE-Cy7-anti-mouse CD3 0.25μg,PE-anti-mouse CD25 0.25μg和FITC-antimouse CD69 0.5μg三種流式抗體,混勻后室溫避光孵育20分鐘。冷PBS洗滌細(xì)胞兩次1 000 r/min,4℃,10分鐘離心后,400μl PBS重懸細(xì)胞后,上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 口服和注射香菇多糖對環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠DTH實驗的影響 環(huán)磷酰胺能夠有效抑制小鼠的DTH反應(yīng),模型組與正常組比較,差異有顯著性意義,P＜0.05;口服或注射香菇多糖后,小鼠DTH反應(yīng)能力均有增強,其中口服組的作用更明顯,與模型組比較,差異有顯著性意義,P＜0.05(圖1)。

2.2 口服和注射香菇多糖對環(huán)磷酰胺免疫抑制的DTH小鼠RLN和PP中T、B淋巴細(xì)胞比例的影響腹腔注射環(huán)磷酰胺后,DTH小鼠RLN和PP中CD3+細(xì)胞的比例明顯升高,模型組與正常組比較,差異均有顯著性意義,P＜0.05。注射或口服香菇多糖后,小鼠的耳后淋巴結(jié)中的T細(xì)胞比例仍會升高,口服組的比例略高于注射組,但與模型組比較,差異均沒有顯著性意義。注射或口服香菇多糖后,小鼠小腸派氏結(jié)中的T細(xì)胞比例均有所下降,其中口服組與模型組比較,差異有顯著性意義,P＜0.05(圖2)。

圖1 香菇多糖對免疫抑制小鼠DTH實驗的影響(±s,n=7)Fig.1 Effect of lentinan on DTH of immune suppressive mice(±s,n=7)

圖2 香菇多糖對DTH小鼠耳后淋巴結(jié)和派氏結(jié)中CD3+細(xì)胞比例的影響(±s,n=7)Fig.2 Effect of lentinan on percentage of CD3+cells in RLN and PPs of DTH mice(±s,n=7)

圖3 香菇多糖對DTH小鼠耳后淋巴結(jié)和派氏結(jié)中CD3+CD69+細(xì)胞比例的影響(±s,n=7)Fig.3 Effect of lentinan on percentage of CD3+CD69+cellsin RLN and PPs of DTH mice( ±s,n=7)

圖4 香菇多糖對DTH小鼠耳后淋巴結(jié)和派氏結(jié)中CD3+CD25+細(xì)胞比例的影響(±s,n=7)Fig.4 Effect of lentinan on percentage of CD3+CD25+cellsin RLN and PPs of DTH mice( ±s,n=7)

2.3 口服和注射香菇多糖對環(huán)磷酰胺免疫抑制的DTH小鼠耳后淋巴結(jié)和小腸派氏結(jié)中T淋巴細(xì)胞活化的影響 腹腔注射環(huán)磷酰胺后,DTH小鼠耳后淋巴結(jié)和小腸派氏結(jié)中T細(xì)胞活化比例明顯下降,與正常組比較,差異均有顯著性意義,P＜0.05?？诜蜃⑸湎愎蕉嗵呛?耳后淋巴結(jié)中的CD3+CD69+細(xì)胞的比例均有升高,其中口服組與模型組比較,差異有顯著性意義,P＜0.05。針對派氏結(jié),口服香菇多糖使其中CD3+CD69+細(xì)胞的比例明顯升高而趨于正常,與模型組比較,差異有顯著性意義,P＜0.05;但在注射組,其中CD3+CD69+細(xì)胞的比例持續(xù)下降,與模型組比較,差異有顯著性意義,P＜0.05;口服和注射香菇多糖后,兩處淋巴結(jié)中CD3+CD25+細(xì)胞的比例均有升高,其中口服組的派氏結(jié)處變化與模型組比較,差異有顯著性意義,P＜0.05(圖 3、4)。

3 討論

腹腔注射環(huán)磷酰胺可以殺傷體內(nèi)的免疫細(xì)胞,有效抑制機體的細(xì)胞免疫和體液免疫,但是不同的淋巴細(xì)胞對環(huán)磷酰胺的敏感性不同,有研究表明腹腔注射環(huán)磷酰胺后,B淋巴細(xì)胞數(shù)量的下降明顯,從而造成T淋巴細(xì)胞比例的相對升高[4,5]。本實驗中,腹腔注射85 mg/kg環(huán)磷酰胺可以明顯抑制小鼠的DTH反應(yīng),升高耳后淋巴結(jié)和小腸派氏結(jié)中T細(xì)胞的比例,降低其活化水平,有效抑制系統(tǒng)免疫和腸道粘膜免疫。

派氏結(jié)是存在于哺乳動物小腸段的集合淋巴小結(jié),屬于腸道粘膜免疫系統(tǒng)的免疫誘導(dǎo)部位,常沿腸系膜對側(cè)分布。派氏結(jié)中含有豐富的胸腺源性T細(xì)胞和B細(xì)胞,T、B細(xì)胞在此經(jīng)過誘導(dǎo)后,分化、成熟,并通過粘附分子、趨化因子和受體介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞移行和歸巢機制到達(dá)粘膜效應(yīng)部位,發(fā)揮免疫效應(yīng)功能[6]。腸道粘膜免疫系統(tǒng)擁有粘膜特有的免疫方式和相對獨立的免疫體系,維持著腸道粘膜局部免疫環(huán)境的平衡。而作為機體系統(tǒng)免疫的重要組成部分,腸道粘膜免疫系統(tǒng)同樣可以通過淋巴細(xì)胞的歸巢機制影響到機體整體免疫。

香菇多糖最先是由日本學(xué)者從香菇子實體中提取出的一種真菌多糖,這類多糖被認(rèn)為具有明顯的抗腫瘤的生物學(xué)活性[7]。研究表明,香菇多糖的主要活性結(jié)構(gòu)β-D-葡聚糖可以結(jié)合到淋巴細(xì)胞表面,活化靶細(xì)胞,誘導(dǎo) IL-1、IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌,從而增強機體的免疫功能[8]。在本實驗中,與環(huán)磷酰胺免疫抑制模型比較,香菇多糖能夠增強免疫抑制小鼠的DTH反應(yīng),降低DTH小鼠腸道派氏結(jié)、右耳后淋巴結(jié)中T細(xì)胞比例,提高其活化水平,提示香菇多糖增強了T細(xì)胞對外界抗原刺激敏感性,促進(jìn)T細(xì)胞的活化,正向調(diào)節(jié)機體的細(xì)胞免疫功能。

通過觀察口服給藥和注射給藥的對比研究發(fā)現(xiàn),無論是腸道派氏結(jié)T細(xì)胞比例、活化或是右耳后淋巴結(jié)T細(xì)胞的活化和小鼠DTH反應(yīng),口服給藥組的效果都明顯優(yōu)于腹腔注射組,且在本實驗的給藥周期內(nèi),派氏結(jié)中T細(xì)胞比例和活化情況都強于耳后淋巴結(jié)。在劉良、周華等對四君子復(fù)方總多糖的免疫調(diào)節(jié)作用的研究中也發(fā)現(xiàn),無論是系統(tǒng)免疫或腸粘膜局部免疫,口服給藥的作用效果都明顯優(yōu)于腹腔注射,這些都提示腸道粘膜免疫系統(tǒng)可能在多糖發(fā)揮免疫藥效中的重要作用[9,10]。但是,由于多糖這類極性大的大分子物質(zhì),在進(jìn)入腸道后,很難以完整結(jié)構(gòu)吸收入血發(fā)揮免疫藥理作用[11]。因此,我們認(rèn)為進(jìn)腸道的香菇多糖很可能直接接觸到腸上皮間的淋巴細(xì)胞或通過借助腸道的M細(xì)胞和DC接觸腸上皮下的免疫細(xì)胞,促進(jìn)局部免疫細(xì)胞的活化,調(diào)整腸道粘膜免疫系統(tǒng)的免疫狀態(tài),在維持腸道局部免疫環(huán)境穩(wěn)定的情況下也可以通過淋巴細(xì)胞歸巢等機制影響到系統(tǒng)免疫狀態(tài)。

粘膜免疫的作用方式和功能不同于細(xì)胞免疫和體液免疫,它具有自身獨特的優(yōu)勢,因此而成為一種理想的免疫途徑。腸道粘膜面積巨大,每時每刻接觸大量抗原,它是機體抗感染的第一道防線,也是機體感染的主要部位之一,肩負(fù)著重要的免疫功能。微生物學(xué)與傳染病學(xué)家Montagne曾經(jīng)說過“腸道內(nèi)壁是人體最大的免疫器官”,由此可以看出腸道粘膜免疫系統(tǒng)在人體免疫系統(tǒng)中占據(jù)著重要地位。鑒于中藥多糖的低吸收率和腸道粘膜免疫與系統(tǒng)免疫之間的聯(lián)系,腸道粘膜免疫系統(tǒng)很可能是口服香菇多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要靶點,藥物在影響腸道粘膜免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,再通過淋巴細(xì)胞歸巢、細(xì)胞因子交流等機制進(jìn)一步影響系統(tǒng)免疫功能。

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